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lx19880717

金虫 (初入文坛)

[求助] pET-28a原核不能表达目的蛋白 已有2人参与

我在做原核表达的过程中,使用了pET-28a载体,Rosetta(DE3)表达菌株,但是37℃诱导表达后,连包涵体都没有看到,基本没有任何的蛋白表达,所以想请问一下大家,能不能帮我分析一下是什么原因?谢谢。
PS:我的目的蛋白大量重复序列,是否是由于重复序列导致蛋白在表达过程中无法折叠,如果是这个原因有什么办法可以解决,谢谢。
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lx19880717

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by wszhyd at 2012-03-12 16:58:46:
我也遇到楼主一样的问题,选用位点是Nco1 和Xho1 ,也是不表达,帮顶一下,希望高人指点一下。

呵呵,谢谢!
3楼2012-03-12 20:33:16
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查看全部 18 个回答

wszhyd

金虫 (初入文坛)

我也遇到楼主一样的问题,选用位点是Nco1 和Xho1 ,也是不表达,帮顶一下,希望高人指点一下。
2楼2012-03-12 16:58:46
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2012-03-14 22:15:48
我跟你一样,也是用的PET28a,不过我用的菌是BL21。
1.你先到上游看看,是不是载体构建的问题;菌p,提质粒酶切,测序看看。
2.上游没问题的话,改变诱导条件试试,T7lac启动子用IPTG1mM诱导6小时看看;
3你的菌有没有问题,可以把构建的重组载体提出来转化到新的感受态试试,我的问题就是这么解决滴
4.换高浓度胶跑跑看看,高浓度提高分辨率。
无善无恶心之体
4楼2012-03-14 17:49:04
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螺旋技术

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励 2012-03-14 22:15:57
先分析是否含有大量的稀有密码子,如果没有,应该能表达。

如果稀有密码子太多,这个问题就很难办了,方法有2:换含有稀有密码子的表达宿主;二:对基因进行密码子优化,在表达。
5楼2012-03-14 20:00:21
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