应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR验证
91/1返回列表
查看: 4122  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

madengyu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-08-24 17:57:17
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

楼主的跑胶时间是不是太长了？
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
2楼2011-08-24 18:58:10
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-24 19:31:15
阴性或PCR失败。跑电泳引物二聚体看得见，但不一定有，引物太少了看不见。
赞一下(1人) 回复此楼
生命不息，探索不止。
3楼2011-08-24 19:10:30
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-08-24 21:39:56
madengyu(金币+2): 2011-08-25 22:05:04
1，菌落（菌液）PCR，1.5ml离心管，如果是1ml装液量摇菌2h时间太短，OD值恐怕0.1都不到，菌还没有长起来，菌体太少。如果是装液量100ul以下摇2h PCR没结果，可能是假阳性。
2，菌落PCR需要质粒是多拷贝，条带才能明显。
3，如果是EB染色，可以试试SybrGreen等高灵敏度染色剂。
4，菌落PCR第一个94℃设置的时间长一点（比如5min），有人建议100℃煮沸1min，离心，取上清PCR，去除菌体碎片对PCR的影响。
5，试验没有做阳性对照，不能排除聚合酶、dNTP、Buffer等其他因素的影响。
6，引物跑电泳是看不到的，引物二聚体可以看到，但是引物设计的好，一般不会有二聚体的，如果在200bp左右看到比较亮的条带，一般是非特异性扩增，而不是二聚体，二聚体没有这么大。
7，电泳时间长短对亮度有很大影响，如同SF所说。
8，关于蓝白斑，也有很多问题的，楼主可以去查一下，这里就不多说了。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-08-24 21:20:14
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-08-24 21:40:09
西瓜(金币+2): Good! 2011-08-26 06:30:58
1、菌液PCR的不确定因素比较多，最好拿一个正确的质粒做模板来做一个正对照；
2、这个Marker跑得很开，有可能引物二聚体跑出去了，也有可能是引物有问题，可以询问一下这个引物是否扩成功过；
3、你说得PCR的样品处理过程、体系都太简单，有可能是模板量太少等等，看不出具体问题在哪里，建议补充一下。我们菌液PCR方案是 取200ul菌液处理，最后添加25ul的水。取20ul作为25ul体系的模板，大体系可同比放大。
赞一下(2人) 回复此楼
生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
5楼2011-08-24 21:21:53
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bubble1220

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good! 2011-08-25 16:47:46
我以前也做不出来，后来发现是菌液太多了。
后来的方法是：小枪头挑单菌落于20微升ddh20中吹打混匀，取1微升做模板即可（25微升体系），屡试不爽啊！
好处是不用扩大培养，直接pcr，而且如果是需要的克隆，也留了备份
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-08-25 10:21:05
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhongmianhua

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 第一帖，鼓励交流 2011-09-04 17:50:28
引用回帖:
4楼: Originally posted by gwbk at 2011-08-24 21:20:14:
1，菌落（菌液）PCR，1.5ml离心管，如果是1ml装液量摇菌2h时间太短，OD值恐怕0.1都不到，菌还没有长起来，菌体太少。如果是装液量100ul以下摇2h PCR没结果，可能是假阳性。
2，菌落PCR需要质粒是多拷贝，条带才能 ...

您好，请问这个具体步骤该怎么做的？

菌落（菌液）PCR，1.5ml离心管，如果是1ml装液量摇菌2h时间太短，OD值恐怕0.1都不到，菌还没有长起来，菌体太少。如果是装液量100ul以下摇2h PCR没结果，可能是假阳性。
赞一下(1人) 回复此楼
体会生活
7楼2011-09-01 20:44:43
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanshuai511

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 鼓励新虫交流 2011-09-04 17:50:08
我们实验室都是挑了克隆在5毫升菌液300转摇8小时左右，只要是引物没问题，阳性的克隆可以p出来的。
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-09-04 11:09:51
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xjtu0025

新虫 (小有名气)
我今天做是刚刚长出来的单克隆,枪头小戳一下,然后点在另一个板上面,然后在已经混好各种东西的PCRMIX里面(20ul)吹一下.94度5mins...鉴定的出,有的就是没有带,有的就是有目的条带呗..不过我用的是载体通用引物...
赞一下 回复此楼
9楼2013-05-24 19:25:37
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 madengyu 的主题更新
91/1返回列表
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +37 医学老男孩 2026-08-13 86/4300 2026-08-18 00:18 by longsantaizi
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +4 基诺咪客 2026-08-17 4/200 2026-08-17 16:10 by Vivilian
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +12 Ldrop2023 2026-08-13 15/750 2026-08-17 15:02 by 小豌豆_发芽
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭