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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

楼主的跑胶时间是不是太长了？

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jiayoubashaonian

2楼2011-08-24 18:58:10

Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

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★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-24 19:31:15

阴性或PCR失败。跑电泳引物二聚体看得见，但不一定有，引物太少了看不见。

生命不息，探索不止。

3楼2011-08-24 19:10:30

gwbk

木虫 (正式写手)

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1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-08-24 21:39:56
madengyu(金币+2): 2011-08-25 22:05:04

1，菌落（菌液）PCR，1.5ml离心管，如果是1ml装液量摇菌2h时间太短，OD值恐怕0.1都不到，菌还没有长起来，菌体太少。如果是装液量100ul以下摇2h PCR没结果，可能是假阳性。
2，菌落PCR需要质粒是多拷贝，条带才能明显。
3，如果是EB染色，可以试试SybrGreen等高灵敏度染色剂。
4，菌落PCR第一个94℃设置的时间长一点（比如5min），有人建议100℃煮沸1min，离心，取上清PCR，去除菌体碎片对PCR的影响。
5，试验没有做阳性对照，不能排除聚合酶、dNTP、Buffer等其他因素的影响。
6，引物跑电泳是看不到的，引物二聚体可以看到，但是引物设计的好，一般不会有二聚体的，如果在200bp左右看到比较亮的条带，一般是非特异性扩增，而不是二聚体，二聚体没有这么大。
7，电泳时间长短对亮度有很大影响，如同SF所说。
8，关于蓝白斑，也有很多问题的，楼主可以去查一下，这里就不多说了。

4楼2011-08-24 21:20:14

xbl3688

银虫 (正式写手)

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★ ★
1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-08-24 21:40:09
西瓜(金币+2): Good! 2011-08-26 06:30:58

1、菌液PCR的不确定因素比较多，最好拿一个正确的质粒做模板来做一个正对照；
2、这个Marker跑得很开，有可能引物二聚体跑出去了，也有可能是引物有问题，可以询问一下这个引物是否扩成功过；
3、你说得PCR的样品处理过程、体系都太简单，有可能是模板量太少等等，看不出具体问题在哪里，建议补充一下。我们菌液PCR方案是取200ul菌液处理，最后添加25ul的水。取20ul作为25ul体系的模板，大体系可同比放大。

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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美

5楼2011-08-24 21:21:53

bubble1220

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good! 2011-08-25 16:47:46

我以前也做不出来，后来发现是菌液太多了。
后来的方法是：小枪头挑单菌落于20微升ddh20中吹打混匀，取1微升做模板即可（25微升体系），屡试不爽啊！
好处是不用扩大培养，直接pcr，而且如果是需要的克隆，也留了备份

6楼2011-08-25 10:21:05

zhongmianhua

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dhd997(金币+5): 第一帖，鼓励交流 2011-09-04 17:50:28

引用回帖:

4楼: Originally posted by gwbk at 2011-08-24 21:20:14:
1，菌落（菌液）PCR，1.5ml离心管，如果是1ml装液量摇菌2h时间太短，OD值恐怕0.1都不到，菌还没有长起来，菌体太少。如果是装液量100ul以下摇2h PCR没结果，可能是假阳性。
2，菌落PCR需要质粒是多拷贝，条带才能 ...

您好，请问这个具体步骤该怎么做的？

菌落（菌液）PCR，1.5ml离心管，如果是1ml装液量摇菌2h时间太短，OD值恐怕0.1都不到，菌还没有长起来，菌体太少。如果是装液量100ul以下摇2h PCR没结果，可能是假阳性。

体会生活

7楼2011-09-01 20:44:43