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madengyu

禁虫 (小有名气)

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xjtu0025

新虫 (小有名气)

我今天做是刚刚长出来的单克隆,枪头小戳一下,然后点在另一个板上面,然后在已经混好各种东西的PCRMIX里面(20ul)吹一下.94度5mins...鉴定的出,有的就是没有带,有的就是有目的条带呗..不过我用的是载体通用引物...
9楼2013-05-24 19:25:37
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

楼主的跑胶时间是不是太长了?
jiayoubashaonian
2楼2011-08-24 18:58:10
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-24 19:31:15
阴性或PCR失败。跑电泳引物二聚体看得见,但不一定有,引物太少了看不见。
生命不息,探索不止。
3楼2011-08-24 19:10:30
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-08-24 21:39:56
madengyu(金币+2): 2011-08-25 22:05:04
1,菌落(菌液)PCR,1.5ml离心管,如果是1ml装液量摇菌2h时间太短,OD值恐怕0.1都不到,菌还没有长起来,菌体太少。如果是装液量100ul以下摇2h PCR没结果,可能是假阳性。
2,菌落PCR需要质粒是多拷贝,条带才能明显。
3,如果是EB染色,可以试试SybrGreen等高灵敏度染色剂。
4,菌落PCR第一个94℃设置的时间长一点(比如5min),有人建议100℃煮沸1min,离心,取上清PCR,去除菌体碎片对PCR的影响。
5,试验没有做阳性对照,不能排除聚合酶、dNTP、Buffer等其他因素的影响。
6,引物跑电泳是看不到的,引物二聚体可以看到,但是引物设计的好,一般不会有二聚体的,如果在200bp左右看到比较亮的条带,一般是非特异性扩增,而不是二聚体,二聚体没有这么大。
7,电泳时间长短对亮度有很大影响,如同SF所说。
8,关于蓝白斑,也有很多问题的,楼主可以去查一下,这里就不多说了。
4楼2011-08-24 21:20:14
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