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姜大磊

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌液PCR,求助。已有8人参与

小弟最近做了一次菌液PCR。 T载体转到大肠感受态之后,LB长出菌落,对菌落摇菌,然后菌液PCR,出来了几个大小不到2000bp的条带(符合要求),但是我提取质粒去测序之后,结果却是空载,(T载体大约2700左右bp)这是怎么回事呢?请各位大侠指教。
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Nevergiveup,neverslowdown;Nevergrowold,nevereverdieyoung......
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
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scelab(金币+3):good idea!:tiger37: 2010-05-15 12:47:00
菌液pcr时,作为模板DNA的既有质粒也有宿主菌的DNA,但宿主菌DNA比质粒打多了,可能是引物结合到了宿主菌DNA模板上了。因为是空载体所以你摇菌是抗性是正确的。你可以用不含载体的宿主菌做个对照看一下。
2楼2010-05-15 09:00:53
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gaozx123

金虫 (小有名气)


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提取的质粒应该分出来一部分做个酶切检测一下。
3楼2010-05-15 09:22:06
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王雨云

金虫 (小有名气)


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提完质粒检测没?说不定没提出来呢!
4楼2010-05-15 10:25:12
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gastrodia

金虫 (正式写手)


1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-15 14:34:33
能导致PCR假阳性的东西很多,建议把菌液再做PCR检测一下,然后换一家公司测序
5楼2010-05-15 11:04:18
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

★ ★
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scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-15 12:47:17
菌落PCR假阳性也很多的,如果你的引物与宿主菌基因组里有匹配,PCR时也会以此为模板扩增出条带的。所以提质粒后酶切验证一下。
我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
6楼2010-05-15 11:06:54
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)


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酶切检测比较好
7楼2010-05-17 02:26:05
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wwllkkhh

金虫 (小有名气)


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没有转进去目的片段
牛~逼~哄~哄
8楼2010-05-17 08:37:57
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liyong1981

金虫 (正式写手)



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PCR不具备说服性,一定要酶切验证~
9楼2010-05-17 11:36:12
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