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madengyu

禁虫 (小有名气)
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2011-08-24 17:57:17
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-24 19:31:15
阴性或PCR失败。跑电泳引物二聚体看得见，但不一定有，引物太少了看不见。
赞一下(1人) 回复此楼
生命不息，探索不止。
3楼2011-08-24 19:10:30
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

楼主的跑胶时间是不是太长了？
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
2楼2011-08-24 18:58:10
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-08-24 21:39:56
madengyu(金币+2): 2011-08-25 22:05:04
1，菌落（菌液）PCR，1.5ml离心管，如果是1ml装液量摇菌2h时间太短，OD值恐怕0.1都不到，菌还没有长起来，菌体太少。如果是装液量100ul以下摇2h PCR没结果，可能是假阳性。
2，菌落PCR需要质粒是多拷贝，条带才能明显。
3，如果是EB染色，可以试试SybrGreen等高灵敏度染色剂。
4，菌落PCR第一个94℃设置的时间长一点（比如5min），有人建议100℃煮沸1min，离心，取上清PCR，去除菌体碎片对PCR的影响。
5，试验没有做阳性对照，不能排除聚合酶、dNTP、Buffer等其他因素的影响。
6，引物跑电泳是看不到的，引物二聚体可以看到，但是引物设计的好，一般不会有二聚体的，如果在200bp左右看到比较亮的条带，一般是非特异性扩增，而不是二聚体，二聚体没有这么大。
7，电泳时间长短对亮度有很大影响，如同SF所说。
8，关于蓝白斑，也有很多问题的，楼主可以去查一下，这里就不多说了。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-08-24 21:20:14
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-08-24 21:40:09
西瓜(金币+2): Good! 2011-08-26 06:30:58
1、菌液PCR的不确定因素比较多，最好拿一个正确的质粒做模板来做一个正对照；
2、这个Marker跑得很开，有可能引物二聚体跑出去了，也有可能是引物有问题，可以询问一下这个引物是否扩成功过；
3、你说得PCR的样品处理过程、体系都太简单，有可能是模板量太少等等，看不出具体问题在哪里，建议补充一下。我们菌液PCR方案是 取200ul菌液处理，最后添加25ul的水。取20ul作为25ul体系的模板，大体系可同比放大。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
5楼2011-08-24 21:21:53
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