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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切连接都是假阳性
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qwqwqwqwq

新虫 (初入文坛)

[交流] 双酶切连接都是假阳性 已有6人参与

我pcr产物进行双酶切后连接到载体上，长得菌全是假阳性。pcr产物没有纯化过，是不是会有影响？
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1楼 2016-08-21 21:03:32
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柳柳好

新虫 (初入文坛)
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没有P出产物？酶切位点，载体过多？

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2楼2016-08-22 11:04:08
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
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会有影响，尤其做连接时，两种片段的纯度及比例对连接效率有很大影响。
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3楼2016-08-22 15:01:10
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矜天

木虫 (正式写手)
★
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PCR完纯了之后，酶切，再纯一次，算好比例，连接，一般都不会出问题。你省略太多了
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4楼2016-08-23 10:59:05
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pooh0216

铜虫 (著名写手)
★
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不纯化肯定是有影响的。假阳性是因为背景太高了吗？你可以做个无片段转化的对照看看。你可以试试vazyme的克隆盒子啊，就不用酶切这么麻烦了
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5楼2016-08-23 11:16:21
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xms0422

铁虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 矜天 at 2016-08-23 10:59:05
PCR完纯了之后，酶切，再纯一次，算好比例，连接，一般都不会出问题。你省略太多了

请问纯化后260/230很低对连接会有影响吗?
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6楼2016-11-28 16:30:47
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矜天

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by xms0422 at 2016-11-28 16:30:47
请问纯化后260/230很低对连接会有影响吗?...

在连接中我都没关注过这个值，我认为纯化试剂盒OK就没事

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7楼2016-11-29 00:02:43
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xms0422

铁虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by 矜天 at 2016-11-29 00:02:43
在连接中我都没关注过这个值，我认为纯化试剂盒OK就没事
...

我要连接一个3000bp的片段，一直连不上，用的是10ul体系，16度过夜，质量比1：10 请问你知道什么改进的方法吗？

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8楼2016-11-29 08:12:24
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嘟嘟教授

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有可能，但也有其他方面的原因，您可以咨询南京诺唯赞技术支持，他们对亚克隆技术经验蛮丰富的，好像产品卖的也不错呢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2016-11-29 13:53:12
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