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质粒构建的问题
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大家好，在此求助个问题，感谢回答： 《质粒构建》 引物退火形成insert后，测shRNA浓度 酶切3h，回收后，测dsDNA浓度 连接16°c，3h （质粒与insert浓度比为1:5） 转化： 1、实验组：连接产物10ul加到100ul感受态细胞中 2、对照组a：酶切后，不加insert，同样加入ligation进行连接 对照组b：感受态细胞不加连接产物，其他条件一样，进行转化 对照组c：酶切后，不加insert，也不加ligation 结果：实验组均长出2-8个菌落 对照组a 长出15个菌落 对照组b 不长 对照组c 长出3个菌落 问题： 奇怪的是，同样的双酶切后载体，为什么没加insert的平板长出的菌落比加了insert的长得还要多？？难道还有连接上又有不表达的？？？这个怎么解释呢？ insert进行Lipo2000转染，结果显示有干扰效果，是否可说明insert制备没问题？ 对照组a与实验组长出菌落数量接近，是否可以得出酶切不成功，长出的都是假阳性呢？ Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ相差6bp，可以用琼脂糖电泳能鉴别出来吗？有什么方法可以在转化前就确定质粒酶切成功呢？ 感谢前辈的支持 此致 敬礼 |
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cicelyzh
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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没加insert的载体有自连，并且比实验组还多，说明载体酶切不完全。实际上任何酶切反应都有完成程度问题，不会是100%。对照C比A菌落少是因为加了ligase之后，线性载体换化，转化效率提高。加入insert后，在连接酶的作用下，可能有一端连上了insert, 而另外一端不匹配，所以insert干扰载体的自连。 相差6bp琼脂糖电泳是不能看出来的。判断酶切是否成功可以在做双酶切的同时分别做两个单酶切的对照实验。然后跑电泳检测。质粒被单酶切开后从超螺旋结构变成线性，很容易从胶上判断。 你的实验组没有多少克隆，可以做菌落PCR筛一下。不过我个人认为你的菌落数很少，比对照组a还少，是阳性克隆的概率不大。 |
2楼2013-01-06 09:18:49
