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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增不出目的条带，求分析原因
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kkkkk76

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增不出目的条带，求分析原因 已有3人参与

我想要扩增的目的条带是500多和600多的，但是不能扩增出目的条带，用的是病毒作为模板，每次都能扩增出1000-2000的非特异性条带（是每次。。。），接近2000了，然后对引物浓度和退火温度都摸索过条件，还是不能得到想要的条带，不考虑引物问题的话，各位大神有什么好的建议吗？对了，我的延伸时间是45s，就很奇怪能扩增出这么长的非特异性条带
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1楼 2015-11-03 11:10:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kkkkk76

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 足下客 at 2015-11-03 13:08:00
你是扩病毒DNA还是RNA？用试剂盒抽提的吗？PCR反应条件是怎样的？用的是什么Taq酶？

病毒DNA，模板的话是试剂盒抽提的，反应条件是
95°-5min
95°-45s
55°-45s
72°-45s
30个循环
72°-10min
用的是rtaq酶
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7楼2015-11-03 19:15:14
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普通回帖

kkkkk76

新虫 (小有名气)
补充下，模板也换过几次实验室使用过的模板
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2楼2015-11-03 11:11:22
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
用的什么酶呢？有的酶扩增速率很快的。
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3楼2015-11-03 12:57:40
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是扩病毒DNA还是RNA？用试剂盒抽提的吗？PCR反应条件是怎样的？用的是什么Taq酶？
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4楼2015-11-03 13:08:00
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不下雨

铜虫 (小有名气)
600以内30s延伸应该足够，每次都扩增不出来考虑下是不是污染了？

发自小木虫Android客户端
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An ideal is a kind of power
5楼2015-11-03 13:19:27
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kkkkk76

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-11-03 12:57:40
用的什么酶呢？有的酶扩增速率很快的。

用的rtaq酶，也试过buffer、dntp+酶的mix，都没目的条带
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6楼2015-11-03 19:12:06
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kkkkk76

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 不下雨 at 2015-11-03 13:19:27
600以内30s延伸应该足够，每次都扩增不出来考虑下是不是污染了？

污染指的是模板污染吗？前后换了有3、4个模板了，师兄师姐也都用这些模板扩增出其他基因
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8楼2015-11-03 19:16:30
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咖啡豆G

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by kkkkk76 at 2015-11-03 19:16:30
污染指的是模板污染吗？前后换了有3、4个模板了，师兄师姐也都用这些模板扩增出其他基因...

不能确定什么有污染，比如引物、模板、buffer，都有可能，不行就做几个阳性和阴性对照吧
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9楼2015-11-03 21:47:52
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by kkkkk76 at 2015-11-03 19:15:14
病毒DNA，模板的话是试剂盒抽提的，反应条件是
95°-5min
95°-45s
55°-45s
72°-45s
30个循环
72°-10min
用的是rtaq酶...

病毒DNA应该比较好扩的呀，建议你做一下温度梯度，你的退火温度55度，不高。温度梯度可以从62度开始，逐步往下降，看能否减少非特异性扩增。估计还是你的引物设计的特异性不够好吧。再就是可能与你用的酶有关系，估计你用的酶扩增效率高，保真性不是很好。可以换一下酶和buffer试试，如果还扩不出来，只能重新设计引物了
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10楼2015-11-04 08:22:37
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