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kkkkk76

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增不出目的条带,求分析原因 已有3人参与

我想要扩增的目的条带是500多和600多的,但是不能扩增出目的条带,用的是病毒作为模板,每次都能扩增出1000-2000的非特异性条带(是每次。。。),接近2000了,然后对引物浓度和退火温度都摸索过条件,还是不能得到想要的条带,不考虑引物问题的话,各位大神有什么好的建议吗?对了,我的延伸时间是45s,就很奇怪能扩增出这么长的非特异性条带
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kkkkk76

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 足下客 at 2015-11-03 13:08:00
你是扩病毒DNA还是RNA?用试剂盒抽提的吗?PCR反应条件是怎样的?用的是什么Taq酶?

病毒DNA,模板的话是试剂盒抽提的,反应条件是
95°-5min
95°-45s
55°-45s
72°-45s
30个循环
72°-10min
用的是rtaq酶
7楼2015-11-03 19:15:14
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普通回帖

kkkkk76

新虫 (小有名气)

补充下,模板也换过几次实验室使用过的模板
2楼2015-11-03 11:11:22
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

用的什么酶呢?有的酶扩增速率很快的。
3楼2015-11-03 12:57:40
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你是扩病毒DNA还是RNA?用试剂盒抽提的吗?PCR反应条件是怎样的?用的是什么Taq酶?
4楼2015-11-03 13:08:00
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不下雨

铜虫 (小有名气)

600以内30s延伸应该足够,每次都扩增不出来考虑下是不是污染了?

发自小木虫Android客户端
An ideal is a kind of power
5楼2015-11-03 13:19:27
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kkkkk76

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-11-03 12:57:40
用的什么酶呢?有的酶扩增速率很快的。

用的rtaq酶,也试过buffer、dntp+酶的mix,都没目的条带
6楼2015-11-03 19:12:06
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kkkkk76

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 不下雨 at 2015-11-03 13:19:27
600以内30s延伸应该足够,每次都扩增不出来考虑下是不是污染了?

污染指的是模板污染吗?前后换了有3、4个模板了,师兄师姐也都用这些模板扩增出其他基因
8楼2015-11-03 19:16:30
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咖啡豆G

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by kkkkk76 at 2015-11-03 19:16:30
污染指的是模板污染吗?前后换了有3、4个模板了,师兄师姐也都用这些模板扩增出其他基因...

不能确定什么有污染,比如引物、模板、buffer,都有可能,不行就做几个阳性和阴性对照吧
9楼2015-11-03 21:47:52
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by kkkkk76 at 2015-11-03 19:15:14
病毒DNA,模板的话是试剂盒抽提的,反应条件是
95°-5min
95°-45s
55°-45s
72°-45s
30个循环
72°-10min
用的是rtaq酶...

病毒DNA应该比较好扩的呀,建议你做一下温度梯度,你的退火温度55度,不高。温度梯度可以从62度开始,逐步往下降,看能否减少非特异性扩增。估计还是你的引物设计的特异性不够好吧。再就是可能与你用的酶有关系,估计你用的酶扩增效率高,保真性不是很好。可以换一下酶和buffer试试,如果还扩不出来,只能重新设计引物了
10楼2015-11-04 08:22:37
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