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kkkkk76

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增不出目的条带,求分析原因 已有3人参与

我想要扩增的目的条带是500多和600多的,但是不能扩增出目的条带,用的是病毒作为模板,每次都能扩增出1000-2000的非特异性条带(是每次。。。),接近2000了,然后对引物浓度和退火温度都摸索过条件,还是不能得到想要的条带,不考虑引物问题的话,各位大神有什么好的建议吗?对了,我的延伸时间是45s,就很奇怪能扩增出这么长的非特异性条带
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by kkkkk76 at 2015-11-03 19:15:14
病毒DNA,模板的话是试剂盒抽提的,反应条件是
95°-5min
95°-45s
55°-45s
72°-45s
30个循环
72°-10min
用的是rtaq酶...

病毒DNA应该比较好扩的呀,建议你做一下温度梯度,你的退火温度55度,不高。温度梯度可以从62度开始,逐步往下降,看能否减少非特异性扩增。估计还是你的引物设计的特异性不够好吧。再就是可能与你用的酶有关系,估计你用的酶扩增效率高,保真性不是很好。可以换一下酶和buffer试试,如果还扩不出来,只能重新设计引物了
10楼2015-11-04 08:22:37
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kkkkk76

新虫 (小有名气)

补充下,模板也换过几次实验室使用过的模板
2楼2015-11-03 11:11:22
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

用的什么酶呢?有的酶扩增速率很快的。
3楼2015-11-03 12:57:40
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你是扩病毒DNA还是RNA?用试剂盒抽提的吗?PCR反应条件是怎样的?用的是什么Taq酶?
4楼2015-11-03 13:08:00
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