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胡彦小科

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR跑不出来的原因 已有6人参与

我的pcr产物用来做酶切的，但是现在做了很多条件的优化，现在就是做不出来！有时能跑出来有时跑不出来。
自己分析原因如下：
1.引物的原因：对引物进行条件摸索时，条带很明显，后我把引物冻存在4摄氏度的冰箱。
2.DNA模板问题，我们用DNA直接跑电泳也有条带出现，并对稀释产物做了梯度PCR，但还是未跑出PCR
3.rTaq酶原因：采用了赛默飞、宝生物、天根用了不同的反应体系
4.PCR仪：用了三种不同的PCR仪都未出结果
已经进行了一个月了还是未出结果，希望大神们能帮忙分析一下原因。好早日做完实验。

PCR跑不出来的原因
引物退火温度梯度PCR.png


PCR跑不出来的原因-1
pcr跑出来的.png


PCR跑不出来的原因-2
DNA.png
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1楼 2015-09-07 09:46:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hbincs

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我原来有过这样的情况，连着一个星期没有一点结果，后来暂停一段时间继续的话就好了。然后看你的图看不出什么问题，你那个PCR程序呢？
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4楼2015-09-07 15:31:13
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普通回帖

枭翔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你应该介绍一下你的电泳图，要不然大家没法帮你解答问题
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2楼2015-09-07 10:54:51
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
图片表述的不是很清楚。
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3楼2015-09-07 13:47:21
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胡彦小科

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hbincs at 2015-09-07 15:31:13
我原来有过这样的情况，连着一个星期没有一点结果，后来暂停一段时间继续的话就好了。然后看你的图看不出什么问题，你那个PCR程序呢？

跑宝生物的rTaq用的程序是94℃，3min，94℃，30s，56℃，30s，72℃，1min，72℃,7min，4℃，保存。我们做了一个月了都不知道怎么回事了，课题组的都不知道怎么回事了，一会跑出来过一会就跑不出来了
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5楼2015-09-08 16:06:53
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胡彦小科

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-07 10:54:51
你应该介绍一下你的电泳图，要不然大家没法帮你解答问题

第一个电泳图跑的是4对引物的退火温度梯度，每对引物有6个梯度的温度。第二张图用这四对引物进行PCR就跑出来过的，后来再跑就没出来过了。然后我们怀疑DNA有问题就对DNA跑胶，看DNA的胶图觉得DNA没得问题,对DNA稀释后也没跑出来。现在想做PCR-RFLP，跑不出PCR没法做酶切
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6楼2015-09-08 16:12:56
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5150416

新虫 (小有名气)
我做的也是，现在也是在摸索温度。毫无头绪

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7楼2015-09-08 17:12:43
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你以前PCR做出来过吗？你的模板G+C含量多少？还有你的图说明下吧。
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8楼2015-09-08 20:36:11
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匿名

用户注销 (正式写手)
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9楼2015-09-08 21:57:21
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jl.liu

新虫 (初入文坛)
建议不要使用那么多PCR去试，在其中选一台市面上公认最稳定的，因为每台PCR仪的条件都是不一样的，要重新摸索。所以，你这几张图是用一台PCR上跑出来的DNA去电泳的吗？有点乱......在你摸索好条件的那台PCR上，换引物去试
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10楼2015-09-09 00:21:25
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