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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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胡彦小科

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

[求助] PCR跑不出来的原因 已有6人参与

我的pcr产物用来做酶切的,但是现在做了很多条件的优化,现在就是做不出来!有时能跑出来有时跑不出来。
自己分析原因如下:
1.引物的原因:对引物进行条件摸索时,条带很明显,后我把引物冻存在4摄氏度的冰箱。
2.DNA模板问题,我们用DNA直接跑电泳也有条带出现,并对稀释产物做了梯度PCR,但还是未跑出PCR
3.rTaq酶原因:采用了赛默飞、宝生物、天根用了不同的反应体系
4.PCR仪:用了三种不同的PCR仪都未出结果
已经进行了一个月了还是未出结果,希望大神们能帮忙分析一下原因。好早日做完实验。

PCR跑不出来的原因
引物退火温度梯度PCR.png


PCR跑不出来的原因-1
pcr跑出来的.png


PCR跑不出来的原因-2
DNA.png
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hbincs

版主

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我原来有过这样的情况,连着一个星期没有一点结果,后来暂停一段时间继续的话就好了。然后看你的图看不出什么问题,你那个PCR程序呢?
4楼2015-09-07 15:31:13
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普通回帖

枭翔

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你应该介绍一下你的电泳图,要不然大家没法帮你解答问题
2楼2015-09-07 10:54:51
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xrxleisure

版主

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
图片表述的不是很清楚。
3楼2015-09-07 13:47:21
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胡彦小科

管理员

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引用回帖:
4楼: Originally posted by hbincs at 2015-09-07 15:31:13
我原来有过这样的情况,连着一个星期没有一点结果,后来暂停一段时间继续的话就好了。然后看你的图看不出什么问题,你那个PCR程序呢?

跑宝生物的rTaq用的程序是94℃,3min,94℃,30s,56℃,30s,72℃,1min,72℃,7min,4℃,保存。我们做了一个月了都不知道怎么回事了,课题组的都不知道怎么回事了,一会跑出来过一会就跑不出来了
5楼2015-09-08 16:06:53
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胡彦小科

超级版主

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引用回帖:
2楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-07 10:54:51
你应该介绍一下你的电泳图,要不然大家没法帮你解答问题

第一个电泳图跑的是4对引物的退火温度梯度,每对引物有6个梯度的温度。第二张图用这四对引物进行PCR就跑出来过的,后来再跑就没出来过了。然后我们怀疑DNA有问题就对DNA跑胶,看DNA的胶图觉得DNA没得问题,对DNA稀释后也没跑出来。现在想做PCR-RFLP,跑不出PCR没法做酶切
6楼2015-09-08 16:12:56
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5150416

实习版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

我做的也是,现在也是在摸索温度。毫无头绪

发自小木虫Android客户端
7楼2015-09-08 17:12:43
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仇峰12306

专家顾问

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你以前PCR做出来过吗?你的模板G+C含量多少?还有你的图说明下吧。
8楼2015-09-08 20:36:11
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匿名

主管区长

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感谢参与,应助指数 +1
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9楼2015-09-08 21:57:21
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jl.liu

管理员

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建议不要使用那么多PCR去试,在其中选一台市面上公认最稳定的,因为每台PCR仪的条件都是不一样的,要重新摸索。所以,你这几张图是用一台PCR上跑出来的DNA去电泳的吗?有点乱......在你摸索好条件的那台PCR上,换引物去试
10楼2015-09-09 00:21:25
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