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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切 菌落PCR
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1楼 2015-08-11 17:40:36
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rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-08-14 23:30:33
@hibi, 你是在做DNA克隆实验，然后用菌液PCR检测是否克隆成功，并从菌液提取了质粒DNA作酶切图检测，对吗? 你的问题是你的11个单克隆菌落都没得到预期的检测结果，询问可能的原因和解决方法，对吗? 你没交代PCR Gel lane 12 是什么，是目的片断PCR阳性对照吗? 你的预期的PCR amplicon 是多大，阳性对照结果正确吗? 这些信息有助于查因分析。

从酶切电泳结果看，质粒10末切时存在(孔11)，但切后消失(孔10)，提示克隆10质粒DNA制备可能有非特异性DNase污染。其它克隆的质粒制备无法评估。

假设你用了100bp ladder, 所有10个克隆菌液PCR都是阴性(同孔11阴性对照)。如果孔12含预期的PCR产物大小，引物和PCR条件可工作，则你的菌液PCR阴性很可能是由于PCR反应受到样品抑制了。样品量太大是常见原因。

从未酶切的质粒孔11和13比郊，末见明显大小差异 (如果你的目的片段很大，应能看到差异)，提示质粒10无目的片段插入，导至PCR阴性。如插入片段小，不好据此判断。

另一可能是所有质粒无目的片段插入。不知你是否使用了好的选择性克隆方法制备和筛选阳性菌落，和有否有"无插入片段"的阴性克隆对照产生假阳性菌落。

建议从复查DNA克隆方法入手，设好必要的阳性和阴性对照，以提高真阳性克隆的判断准确度。如无好的过确筛选方法，可考虑使用快速茵落裂解电泳质粒比较法。或你的菌液PCR法，加上必要的对照以确证PCR本身完好工作。如目的片段PCR阳性对照，阴性菌液加目的片段阳性对照，都应如预期工作，否则PCR本身有问题，先要解决。质粒制备可通过65C热处理灭活RNase污染如果有怀疑的话。酶切可加无酶切对照，己确证使用了适量的质粒DNA。祝成功!

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5楼2015-08-12 07:40:26
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6楼2015-08-12 09:49:56
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液PCR不带这么玩的，pfu做菌液PCR，楼主真是土豪啊，效果未必好，RNA都不搞干净，酶切就算了吧

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2楼2015-08-11 18:09:43
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3楼2015-08-11 19:19:15
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lijianfu12

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液pcr不用煮，直接加进去！

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好好搞学术
4楼2015-08-11 23:22:27
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by hibi at 2015-08-12 09:49:56
不都是提完质粒去做酶切的麽  rna会影响酶切麽...

你都看不到酶切的结果了，你说影响不？

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7楼2015-08-12 10:17:16
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匿名

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8楼2015-08-12 10:22:42
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9楼2015-08-12 10:27:45
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弑者星魂

金虫 (正式写手)
有钱。。。。

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10楼2015-08-12 10:56:20
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