应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切 菌落PCR
231/3返回列表123下一页
查看: 2087  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-08-11 17:40:36
已阅   同方向广播   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-08-14 23:30:33
@hibi, 你是在做DNA克隆实验，然后用菌液PCR检测是否克隆成功，并从菌液提取了质粒DNA作酶切图检测，对吗? 你的问题是你的11个单克隆菌落都没得到预期的检测结果，询问可能的原因和解决方法，对吗? 你没交代PCR Gel lane 12 是什么，是目的片断PCR阳性对照吗? 你的预期的PCR amplicon 是多大，阳性对照结果正确吗? 这些信息有助于查因分析。

从酶切电泳结果看，质粒10末切时存在(孔11)，但切后消失(孔10)，提示克隆10质粒DNA制备可能有非特异性DNase污染。其它克隆的质粒制备无法评估。

假设你用了100bp ladder, 所有10个克隆菌液PCR都是阴性(同孔11阴性对照)。如果孔12含预期的PCR产物大小，引物和PCR条件可工作，则你的菌液PCR阴性很可能是由于PCR反应受到样品抑制了。样品量太大是常见原因。

从未酶切的质粒孔11和13比郊，末见明显大小差异 (如果你的目的片段很大，应能看到差异)，提示质粒10无目的片段插入，导至PCR阴性。如插入片段小，不好据此判断。

另一可能是所有质粒无目的片段插入。不知你是否使用了好的选择性克隆方法制备和筛选阳性菌落，和有否有"无插入片段"的阴性克隆对照产生假阳性菌落。

建议从复查DNA克隆方法入手，设好必要的阳性和阴性对照，以提高真阳性克隆的判断准确度。如无好的过确筛选方法，可考虑使用快速茵落裂解电泳质粒比较法。或你的菌液PCR法，加上必要的对照以确证PCR本身完好工作。如目的片段PCR阳性对照，阴性菌液加目的片段阳性对照，都应如预期工作，否则PCR本身有问题，先要解决。质粒制备可通过65C热处理灭活RNase污染如果有怀疑的话。酶切可加无酶切对照，己确证使用了适量的质粒DNA。祝成功!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2015-08-12 07:40:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
6楼2015-08-12 09:49:56
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
普通回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液PCR不带这么玩的，pfu做菌液PCR，楼主真是土豪啊，效果未必好，RNA都不搞干净，酶切就算了吧

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2015-08-11 18:09:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
3楼2015-08-11 19:19:15
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

lijianfu12

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液pcr不用煮，直接加进去！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
好好搞学术
4楼2015-08-11 23:22:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by hibi at 2015-08-12 09:49:56
不都是提完质粒去做酶切的麽  rna会影响酶切麽...

你都看不到酶切的结果了，你说影响不？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2015-08-12 10:17:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
8楼2015-08-12 10:22:42
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
9楼2015-08-12 10:27:45
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

弑者星魂

金虫 (正式写手)
有钱。。。。

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
10楼2015-08-12 10:56:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hibi 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 HFw0lei2R37i 2026-08-14 8/400 2026-08-15 00:16 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 22/1100 2026-08-14 23:45 by Noways
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +23 医学老男孩 2026-08-13 49/2450 2026-08-14 20:02 by zhaifei
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-14 18:36 by 正能量1斤
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +6 majunge000 2026-08-11 8/400 2026-08-14 14:44 by 医学老男孩
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[基金申请] 好奇怪的filecode +6 布布和一二 2026-08-08 7/350 2026-08-14 13:38 by Equinoxhua
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +10 Tide man 2026-08-10 11/550 2026-08-14 10:30 by 沁言学术
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭