应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切 菌落PCR
232/3返回列表上一页123下一页
查看: 1804  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

RNA 污染一般不会影响DNA酶切。但DNase污染会降解质粒DNA。"质粒制备可通过65C热处理灭活DNase污染, 如果有怀疑的话" (我在前贴中误写成RNase了)。也可缩短酶切时间，37C, 1 到几个小时即可。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
11楼2015-08-12 12:04:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ppppppppp

新虫 (小有名气)
土豪啊，做一次鉴定加四次的用量，一次十元就是四十元了，直接测序都可以测两三个了。建议鉴定的时候用生工的酶，很便宜，一次几毛钱
赞一下 回复此楼
初来乍到，请多指教
12楼2015-08-12 12:55:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
13楼2015-08-12 13:27:24
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
14楼2015-08-12 13:28:10
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by hibi at 2015-08-12 10:22:42
是在做DNA克隆实验，然后用菌液PCR检测来验证克隆是否成功，并从菌液提取了质粒DNA作酶切图检测，但 我的问题是10个单克隆菌落都没得到预期的检测结果，所以来询问可能的原因和解决方法的。 我的预期的目的片段是4 ...

1. 菌液PCR, 第12孔空载体PCR出了阳性结果是假阳性，是不对的。应复查引物设计。另你应加上一个真阳性(插入片断DNA)对照PCR，以便正确分析。
2. 酶切图，第11孔未切对照有否并行37C14小时？如没有，可以解释为何不降解，不能找除DNase污染的可能。可试加温灭活，和缩短酶切时间。
3. 氨苄筛选，要有好对照。如设无插入片段空载体联结对照转化，没有给出假阳性转化菌落，则试验组的阳性为空载假阳性的概率很低。否则难说。
4. 另外，你的插入片断是怎么制备和用于月载体DNA联结的? 如是通过Pfu DNA聚合酶PCR扩增和直接酶切制备，小心酶切粘性末端被Pfu破坏，干扰联结反应。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
15楼2015-08-12 13:35:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

人车

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的空载体质粒跑出来的条带为什么会是这个样子的呢？ 而且空载体PCR用目的基因的引物正常也是P不出来的啊 除非你用的是载体的通用测序引物
赞一下 回复此楼
16楼2015-08-12 14:37:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
17楼2015-08-12 15:29:53
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
18楼2015-08-12 15:39:10
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hibi: 金币+10 2015-08-12 16:22:58
引用回帖:
18楼: Originally posted by hibi at 2015-08-12 15:39:10
1  目前正在筛选真阳性克隆  所以没有真阳性(插入片断DNA)对照PCR
2.之前做过空载体进行转化 长出的也是白斑跟现在连接目的片段转化后长出的白斑都一样的 没办法分辨的 而且我的载体是不能做蓝白班筛选的
3，目 ...

1. 知道你还在克隆真阳性克隆。我指的是用目的片段DNA作PCR模版对照。
2. 你的载体质粒DNA制备，用双酶切后有作脱磷处理以防止自环化联结产生假阳性克隆吗? 如无，可试增此步骤。
3. 你的Taq pol PCR产物，可稀释后用作茵液PCR阳性模板对照。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
19楼2015-08-12 16:09:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
20楼2015-08-12 16:22:46
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
相关版块跳转 我要订阅楼主 hibi 的主题更新
232/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭