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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

RNA 污染一般不会影响DNA酶切。但DNase污染会降解质粒DNA。"质粒制备可通过65C热处理灭活DNase污染, 如果有怀疑的话" (我在前贴中误写成RNase了)。也可缩短酶切时间，37C, 1 到几个小时即可。

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11楼2015-08-12 12:04:37
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ppppppppp

新虫 (小有名气)
土豪啊，做一次鉴定加四次的用量，一次十元就是四十元了，直接测序都可以测两三个了。建议鉴定的时候用生工的酶，很便宜，一次几毛钱
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初来乍到，请多指教
12楼2015-08-12 12:55:28
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匿名

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13楼2015-08-12 13:27:24
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14楼2015-08-12 13:28:10
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rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by hibi at 2015-08-12 10:22:42
是在做DNA克隆实验，然后用菌液PCR检测来验证克隆是否成功，并从菌液提取了质粒DNA作酶切图检测，但 我的问题是10个单克隆菌落都没得到预期的检测结果，所以来询问可能的原因和解决方法的。 我的预期的目的片段是4 ...

1. 菌液PCR, 第12孔空载体PCR出了阳性结果是假阳性，是不对的。应复查引物设计。另你应加上一个真阳性(插入片断DNA)对照PCR，以便正确分析。
2. 酶切图，第11孔未切对照有否并行37C14小时？如没有，可以解释为何不降解，不能找除DNase污染的可能。可试加温灭活，和缩短酶切时间。
3. 氨苄筛选，要有好对照。如设无插入片段空载体联结对照转化，没有给出假阳性转化菌落，则试验组的阳性为空载假阳性的概率很低。否则难说。
4. 另外，你的插入片断是怎么制备和用于月载体DNA联结的? 如是通过Pfu DNA聚合酶PCR扩增和直接酶切制备，小心酶切粘性末端被Pfu破坏，干扰联结反应。

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15楼2015-08-12 13:35:07
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人车

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的空载体质粒跑出来的条带为什么会是这个样子的呢？ 而且空载体PCR用目的基因的引物正常也是P不出来的啊 除非你用的是载体的通用测序引物
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16楼2015-08-12 14:37:52
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匿名

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17楼2015-08-12 15:29:53
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匿名

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18楼2015-08-12 15:39:10
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rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hibi: 金币+10 2015-08-12 16:22:58
引用回帖:
18楼: Originally posted by hibi at 2015-08-12 15:39:10
1  目前正在筛选真阳性克隆  所以没有真阳性(插入片断DNA)对照PCR
2.之前做过空载体进行转化 长出的也是白斑跟现在连接目的片段转化后长出的白斑都一样的 没办法分辨的 而且我的载体是不能做蓝白班筛选的
3，目 ...

1. 知道你还在克隆真阳性克隆。我指的是用目的片段DNA作PCR模版对照。
2. 你的载体质粒DNA制备，用双酶切后有作脱磷处理以防止自环化联结产生假阳性克隆吗? 如无，可试增此步骤。
3. 你的Taq pol PCR产物，可稀释后用作茵液PCR阳性模板对照。

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19楼2015-08-12 16:09:41
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匿名

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20楼2015-08-12 16:22:46
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