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匿名

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1楼 2015-08-11 17:40:36

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rdfu510

铁虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

8楼: Originally posted by hibi at 2015-08-12 10:22:42
是在做DNA克隆实验，然后用菌液PCR检测来验证克隆是否成功，并从菌液提取了质粒DNA作酶切图检测，但我的问题是10个单克隆菌落都没得到预期的检测结果，所以来询问可能的原因和解决方法的。我的预期的目的片段是4 ...

1. 菌液PCR, 第12孔空载体PCR出了阳性结果是假阳性，是不对的。应复查引物设计。另你应加上一个真阳性(插入片断DNA)对照PCR，以便正确分析。
2. 酶切图，第11孔未切对照有否并行37C14小时？如没有，可以解释为何不降解，不能找除DNase污染的可能。可试加温灭活，和缩短酶切时间。
3. 氨苄筛选，要有好对照。如设无插入片段空载体联结对照转化，没有给出假阳性转化菌落，则试验组的阳性为空载假阳性的概率很低。否则难说。
4. 另外，你的插入片断是怎么制备和用于月载体DNA联结的? 如是通过Pfu DNA聚合酶PCR扩增和直接酶切制备，小心酶切粘性末端被Pfu破坏，干扰联结反应。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]