24小时热门版块排行榜    

查看: 2084  |  回复: 22
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

匿名

用户注销 (小有名气)

本帖仅楼主可见

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   同方向广播   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

lijianfu12

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菌液pcr不用煮,直接加进去!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
好好搞学术
4楼2015-08-11 23:22:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菌液PCR不带这么玩的,pfu做菌液PCR,楼主真是土豪啊,效果未必好,RNA都不搞干净,酶切就算了吧

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2015-08-11 18:09:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)

本帖仅楼主可见
3楼2015-08-11 19:19:15
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

rdfu510

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-08-14 23:30:33
@hibi, 你是在做DNA克隆实验,然后用菌液PCR检测是否克隆成功,并从菌液提取了质粒DNA作酶切图检测,对吗? 你的问题是你的11个单克隆菌落都没得到预期的检测结果,询问可能的原因和解决方法,对吗? 你没交代PCR Gel lane 12 是什么,是目的片断PCR阳性对照吗? 你的预期的PCR amplicon 是多大,阳性对照结果正确吗? 这些信息有助于查因分析。

从酶切电泳结果看,质粒10末切时存在(孔11),但切后消失(孔10),提示克隆10质粒DNA制备可能有非特异性DNase污染。其它克隆的质粒制备无法评估。

假设你用了100bp ladder, 所有10个克隆菌液PCR都是阴性(同孔11阴性对照)。如果孔12含预期的PCR产物大小,引物和PCR条件可工作,则你的菌液PCR阴性很可能是由于PCR反应受到样品抑制了。样品量太大是常见原因。

从未酶切的质粒孔11和13比郊,末见明显大小差异 (如果你的目的片段很大,应能看到差异),提示质粒10无目的片段插入,导至PCR阴性。如插入片段小,不好据此判断。

另一可能是所有质粒无目的片段插入。不知你是否使用了好的选择性克隆方法制备和筛选阳性菌落,和有否有"无插入片段"的阴性克隆对照产生假阳性菌落。

建议从复查DNA克隆方法入手,设好必要的阳性和阴性对照,以提高真阳性克隆的判断准确度。如无好的过确筛选方法,可考虑使用快速茵落裂解电泳质粒比较法。或你的菌液PCR法,加上必要的对照以确证PCR本身完好工作。如目的片段PCR阳性对照,阴性菌液加目的片段阳性对照,都应如预期工作,否则PCR本身有问题,先要解决。质粒制备可通过65C热处理灭活RNase污染如果有怀疑的话。酶切可加无酶切对照,己确证使用了适量的质粒DNA。祝成功!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2015-08-12 07:40:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +23 医学老男孩 2026-08-13 49/2450 2026-08-14 20:02 by zhaifei
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +6 启萌科技 2026-08-12 21/1050 2026-08-14 19:48 by 启萌科技
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜? +5 Ldrop2023 2026-08-13 5/250 2026-08-14 18:48 by ssxclkj
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-14 18:36 by 正能量1斤
[基金申请] filecode +6 cratir 2026-08-14 10/500 2026-08-14 18:29 by 笑叹辞穷
[基金申请] 奇怪,两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[基金申请] 好奇怪的filecode +6 布布和一二 2026-08-08 7/350 2026-08-14 13:38 by Equinoxhua
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +10 Tide man 2026-08-10 11/550 2026-08-14 10:30 by 沁言学术
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读? +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode,很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
信息提示
请填处理意见