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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切PCR产物-连接表达载体
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ashap

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切PCR产物-连接表达载体

我的PCR产物回收纯化后酶切，再连接到表达载体里头后涂板没有长出菌落。
PCR产物回收纯化后酶切，对引物的保护碱基有什么要求吗
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1楼 2013-09-14 13:37:24
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-14 16:05:06
遇到的问题和链接的这位虫友情况一样，应该也多事胶回收的问题，可以参考下面的链接内容：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6358938&authorid=1430329
希望有所帮助，祝楼主早日成功！相互学习，共同进步哈！
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
2楼2013-09-14 13:47:19
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不确定能否切开就先TA克隆吧。
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生物资源交流QQ群：1044518333
3楼2013-09-14 18:02:45
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ykluuniu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ashap: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-15 15:58:28
1.首先，需要确定你的问题所在。
1.1产物纯化后的质量如何？
1.2感受态是否存在问题？
1.3转化过程是否存在问题？
1.4PCR产物所加的保护碱基？这个保护碱基应该根据不同的酶以及引物GC含量进行选择。一般的酶，加三个保护碱基就足够啦，有的酶比较特殊，要加到六个保护碱基。保护碱基根据GC含量加，引物GC含量多就加A和（或）T，反之，加G和（或）C。
1.5目的片段与载体的摩尔数比？载体一般100-200ng，目的片段尽可能地多。
1.6细菌平板抗性是否合适？抗生素浓度是否合适？
首先从这些方面一一排查，找出问题。
2.其实，没有必要先连T载体，一方面，高保真酶扩增的片段一般没有A尾，需要加尾，麻烦。另外，还需要多做一次纯化，酶切及连接，麻烦。

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4楼2013-09-14 19:32:33
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ykluuniu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

补充:转化时，连接产物为感受态细胞体积的4-5％为宜，绝对不要加得过多。1ng的纯质粒就能饱和100ul体积的感受态细胞。连接产物加太多，感受态细胞承受不了。
另外，转化涂板是怎么做的？涂布棒必须冷却哦！涂200ul就足够啦，如果菌液不易被吸收的话，就涂布均匀后，先正置培养1小时，这时菌液被完全吸收，然后再倒置培养。

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5楼2013-09-14 19:40:54
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ashap

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ykluuniu at 2013-09-14 19:32:33
1.首先，需要确定你的问题所在。
1.1产物纯化后的质量如何？
1.2感受态是否存在问题？
1.3转化过程是否存在问题？
1.4PCR产物所加的保护碱基？这个保护碱基应该根据不同的酶以及引物GC含量进行选择。一般的酶， ...

谢谢啦！我就只有1.5这个没注意，有可能是浓度不对的原因，先做一次试试。
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6楼2013-09-15 15:58:17
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ashap

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ykluuniu at 2013-09-14 19:40:54
补充:转化时，连接产物为感受态细胞体积的4-5％为宜，绝对不要加得过多。1ng的纯质粒就能饱和100ul体积的感受态细胞。连接产物加太多，感受态细胞承受不了。
另外，转化涂板是怎么做的？涂布棒必须冷却哦！涂200ul ...

我看很多试剂说明书都没强调转化的质粒质量，都说的是T4连接过后体积为10ul，这是咋回事儿呢
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7楼2013-09-15 16:00:57
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ashap at 2013-09-15 16:00:57
我看很多试剂说明书都没强调转化的质粒质量，都说的是T4连接过后体积为10ul，这是咋回事儿呢...

1.T4连接酶的说明书会推荐10ul连接体系中，载体的用量，100-200ng是经典用量。
2.感受态的说明书会推荐连接产物的用量。

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8楼2013-09-15 16:30:29
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ashap at 2013-09-15 15:58:17
谢谢啦！我就只有1.5这个没注意，有可能是浓度不对的原因，先做一次试试。...

1.一般载体100-200ng，然后，在10ul的连接体系中，目的片段的数目尽可能地多，这样是增加连接效率。毕竟，重组质粒的核心环节是连接这部。
2.目的片段和载体酶切后，回收的质量很重要，不能含有抑制连接酶作用的杂质啊。
3.上述两点是核心，当然，是建立在其他所有操作和步骤都完全没有问题的基础上。

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9楼2013-09-15 16:38:15
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厦大生物杨超

铜虫 (初入文坛)
我做过类似的实验 用酶切PCR产物是不靠谱的 根本切不动 必须构建TA克隆才行 一天的事 不会麻烦~
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Nosweetwithoutsweat！
10楼2013-09-15 22:18:45
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