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酶切PCR产物-连接表达载体
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我的PCR产物回收纯化后酶切，再连接到表达载体里头后涂板没有长出菌落。 PCR产物回收纯化后酶切，对引物的保护碱基有什么要求吗 |
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8楼2013-09-15 16:30:29
yudaoqian88
至尊木虫 (知名作家)
不良人
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【答案】应助回帖
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-14 16:05:06
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遇到的问题和链接的这位虫友情况一样，应该也多事胶回收的问题，可以参考下面的链接内容：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6358938&authorid=1430329 希望有所帮助，祝楼主早日成功！相互学习，共同进步哈！ |
2楼2013-09-14 13:47:19
snoopyzxx
木虫 (著名写手)
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3楼2013-09-14 18:02:45
【答案】应助回帖
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ashap: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-15 15:58:28
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ashap: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-15 15:58:28
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1.首先，需要确定你的问题所在。 1.1产物纯化后的质量如何？ 1.2感受态是否存在问题？ 1.3转化过程是否存在问题？ 1.4PCR产物所加的保护碱基？这个保护碱基应该根据不同的酶以及引物GC含量进行选择。一般的酶，加三个保护碱基就足够啦，有的酶比较特殊，要加到六个保护碱基。保护碱基根据GC含量加，引物GC含量多就加A和（或）T，反之，加G和（或）C。 1.5目的片段与载体的摩尔数比？载体一般100-200ng，目的片段尽可能地多。 1.6细菌平板抗性是否合适？抗生素浓度是否合适？ 首先从这些方面一一排查，找出问题。 2.其实，没有必要先连T载体，一方面，高保真酶扩增的片段一般没有A尾，需要加尾，麻烦。另外，还需要多做一次纯化，酶切及连接，麻烦。 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
4楼2013-09-14 19:32:33
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