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970402570

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌落PCR

请问，做菌落PCR前要保留菌种，一般用固体培养基还是液体培养基？保存时放在什么条件下？保留的菌种干什么用？一般PCR退火温度是多少？还有PCR之后还要必需做质粒酶切鉴定鉴定吗？
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1楼 2013-02-19 17:41:53
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题 2013-02-19 19:50:26
菌落PCR一般挑取菌落后振荡培养6h,然后 直接PCR，一般55度退火即可。我一般都是一次用两对引物鉴定 ，正确的话直接测序。 这期间 菌液都在4度保存 ，正确后才放-80
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2楼2013-02-19 18:44:09
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970402570

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2013-02-19 18:44:09
菌落PCR一般挑取菌落后振荡培养6h,然后 直接PCR，一般55度退火即可。我一般都是一次用两对引物鉴定 ，正确的话直接测序。 这期间 菌液都在4度保存 ，正确后才放-80

好 谢谢啦
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3楼2013-02-19 21:03:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励分享经验 2013-02-20 17:08:44
970402570: 金币+1, ★有帮助 2013-02-24 20:47:52
我的做法是用无菌枪头挑菌落，点在固体平板上编号保存。然后用此枪头直接在相同编号的PCR管里搅若干下去PCR。PCR退火温度要根据不同引物来。平板是放37°C。一般早上做的话，下午平板就长好了，可以放到4度。由于PCR可能有假阳性，对PCR正确的克隆，挑保种的平板上相应编号的克隆摇菌，小提质粒做酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆送去测序（如果需要的话）。
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4楼2013-02-20 08:01:14
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