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970402570

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌落PCR

请问,做菌落PCR前要保留菌种,一般用固体培养基还是液体培养基?保存时放在什么条件下?保留的菌种干什么用?一般PCR退火温度是多少?还有PCR之后还要必需做质粒酶切鉴定鉴定吗?
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题 2013-02-19 19:50:26
菌落PCR一般挑取菌落后振荡培养6h,然后 直接PCR,一般55度退火即可。我一般都是一次用两对引物鉴定 ,正确的话直接测序。 这期间 菌液都在4度保存 ,正确后才放-80
2楼2013-02-19 18:44:09
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970402570

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2013-02-19 18:44:09
菌落PCR一般挑取菌落后振荡培养6h,然后 直接PCR,一般55度退火即可。我一般都是一次用两对引物鉴定 ,正确的话直接测序。 这期间 菌液都在4度保存 ,正确后才放-80

好 谢谢啦
3楼2013-02-19 21:03:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励分享经验 2013-02-20 17:08:44
970402570: 金币+1, 有帮助 2013-02-24 20:47:52
我的做法是用无菌枪头挑菌落,点在固体平板上编号保存。然后用此枪头直接在相同编号的PCR管里搅若干下去PCR。PCR退火温度要根据不同引物来。平板是放37°C。一般早上做的话,下午平板就长好了,可以放到4度。由于PCR可能有假阳性,对PCR正确的克隆,挑保种的平板上相应编号的克隆摇菌,小提质粒做酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆送去测序(如果需要的话)。
4楼2013-02-20 08:01:14
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