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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段的连接
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郑凤席

新虫 (小有名气)

[求助] 目的片段的连接 已有6人参与

我将目的片段与19-T连接转化，进行蓝白斑筛选，可是结果平板上要么什么都不长，要么就是全部长白斑没有蓝斑并且菌落稀少又大个。这到底是什么原因呢？请各位大神指点迷津！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2015-07-07 23:50:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
郑凤席: 金币+2, ★有帮助, 这些我都做过，验证过，没有得到我想要的答案，不过还是感谢ta 2015-07-10 15:55:00
估计是平板倒的不好，AMP没有起作用或者感受态细胞不好。
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123456
2楼2015-07-08 13:27:49
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nonglong1

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
郑凤席: 金币+2, ★有帮助, 我觉得这都不是关键，因为这些东西我肯定不会忘记 2015-07-10 15:56:13
长白斑就对了，插入目的基因后是白斑，空载是蓝斑。另外，记得加X-gal和IPTG，否则当然都是白斑。
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植物学
3楼2015-07-08 16:32:05
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Look_2014

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
郑凤席: 金币+1, ★★★很有帮助, 我会试着在改改链接条件 2015-07-10 15:57:46
原因可能有很多，1.目的片段回收质量   2.连接体系（目的片段与载体的比例有要求）3.连接条件  你自己慢慢尝试，祝好运

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Look
6楼2015-07-09 10:55:25
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wsad5213

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-07-10 21:05:32
首先你要确定你的AMP浓度是正确的，不存在问题，并且在操作过程中做好灭菌工作，防止污染。如果这些都没问题，长出来来的菌不是你要的阳性菌，很可能是是在连接转化过程中出现问题，你的片段如果不是很大的话，连接一般没有问题，你看看是不是你制备的感受态细胞不是很好！good luck
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7楼2015-07-09 16:25:06
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普通回帖

郑凤席

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nonglong1 at 2015-07-08 16:32:05
长白斑就对了，插入目的基因后是白斑，空载是蓝斑。另外，记得加X-gal和IPTG，否则当然都是白斑。

药品全都加了，全是白的应该是有问题的吧？我检测过白斑都是没有我要的目的前段

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4楼2015-07-09 08:14:43
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郑凤席

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-07-08 13:27:49
估计是平板倒的不好，AMP没有起作用或者感受态细胞不好。

药品都没问题 感受态试过很多种  结果都是一样的

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5楼2015-07-09 08:15:49
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BBMC-2012

木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你放冰箱两三个小时后看看，怀疑你的感受态有问题！

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8楼2015-07-09 16:34:41
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郑凤席

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by BBMC-2012 at 2015-07-09 16:34:41
你放冰箱两三个小时后看看，怀疑你的感受态有问题！

我培养的时间最少12h  最多20h两者都有放在冰箱  不管放多久都没有出现蓝斑  但是我不连载体的就只是目的片段的平板又有全是蓝斑   这样看来  感受态应该没问题吧？

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9楼2015-07-09 22:57:03
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郑凤席

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Look_2014 at 2015-07-09 10:55:25
原因可能有很多，1.目的片段回收质量   2.连接体系（目的片段与载体的比例有要求）3.连接条件  你自己慢慢尝试，祝好运

目的片段的回收经过检测  指导老师说没问题   连接体系是按照指导老师定的   反应条件也试过很多   结果都一样   不过还是谢谢你！

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10楼2015-07-09 23:00:32
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