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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

[求助] 哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗已有2人参与

打算做race，试剂盒也买好了，但是在设计GSP上遇到了问题，在oligo7上单独搜索上游引物或下游引物失败（限定了在保守区内），按对搜索的时候能成功，但问题是本应该在靠近5‘端设计3’race用的forward GSP primer，在靠近3‘端设计5’race用的reverse GSP primer，按对搜索的时候就反过来了，上游引物在5‘端，下游引物在3’端。而且我看说明书上说引物3‘端的GC含量要低，3’端最末的5个碱基中G或C不得多于2个，但是我设计的没有一条能达到要求。现附上序列，请高手帮帮忙吧，感激不尽！
GCCCTTTTATGCCTTTGAACCACTCGAATGAACCTTGTTCCCTTGTCACCCAATAGAAGTATGCTTTTCTTGTATTGAATGATGAATTCTTGTTGTTGTTGTTTACTGTTAATCCTGACTCTAAATTGTTGTCTTCTGATTTCATGTTGTTGATGATGTCTTTGACTATGCTGATCATGGGAGTAGCCCCAATTCCAAGCCCCACTAGTAGCACTACATCATATTTTTTATAGTCTTGAGCTGGTGCTCCATATGGTCCGTCTATTAATATCTTTGGAAACCCTCGAGAGTTATTTTCCCTTTCTGCTCTAAGAAGACCGCTCTTCCCAGCAGGTGCAGGCTGGCAAACCTCAGAGAAAACTGTCTTAAGCTGCCTAGTCCAATCGCCCAAAGTTCGGATATGAACGCTGAGGTAGTCATCTCCTGGTGATGATGTGATGGAAAACGGATGCCATTCGAACGGTGAGACGGCAGCGCAATTTACGAACATGTACTGTCCGCTCTTGTATTTGAAGCCTTGTGGTTTTGACATGTGTAATGCCAAGGCATTTCCAGGATAAACAGCAACCTTGAGAATCTTGACAGGCTCGATGCTTGATCTCAAAGCTCTAGTCAATCTCTCACAAGCATAAAGAACCATCGGGACAGCCAGATACATCCATGTCGTCTTCTGATACCATTTCTTGGTGAGATAGAGTTTAATTCCATGGACAATGAGAGGGGTATAGACAATGATGAAAAGATGATGTGAGTACCAAAAGGCATTGAATCCAGTGAGTCTTTTAAGTGGTTTTGGCAGATTGAGCTTGTTGCGCCTGAACCAAGGCGTTGCCAAAGTGAATGCTATCACCATTAACACCACCATTATGATCCCTGTTACTCCTTCAACTCCCTTTACAAACCACCAGTAATTATCCGGTTGCTCGTCCCCAAAGTAAGGCTTCATTGGCTCGTATTCTTCTTCAGTCGCGTGGAGGAGTCGCGGGAAATCACAGGTTAGATGAGCTCCGCCGTGTAATATAACTCCAATCCCAATTCCAACCGCGATCACCTTATGGAAATTTAAGTTGTCATCGAAAGGGACAACAAGTCCTAATTTAGTTTTGTTTCTGAGCCATGTGATGGTGTTTCGGCAAACTGGTAATAATATCAAGGCCATGTTGAATTTAAGTGTCTCTGCTCCTCCTTTAGCAATGCAAACGCAATAGCCCATCACATCATAAGCAGCCTTGTTTCGGTACTGCACAAACTTGTAGGCAAATAAACCCCCGACAATTCCAAGCCACAACAGCATAATCCAAACCCTTTGCCAATTATCCATCAAAAAGTACTTAATCTTCTGATAACATTTTCGTAATGGGTTGTTTTCTTGGGTTGGCTTCAGCTTCTGGCTCAACATTTGACTCAGAATTCGACTGTCTCCTACTCTTACAGATTGATTTGGAGCTTGCAACAACAATGTTTCCAGGTTATGAATCATGATGTATCCGGCATTGTCAGGGTCTAATTCTTCCATAATCATGGCTGCATATTCCTCTGCTTGTTTCTGAATGTTGGAGAGCTTGTTTGCAGAAGCACTCAGACTAATAATCTCTTTGACTTCTTCTTCAGTGATTCTTCCATCAGCGTCTGTGTCGACCATGTCAAAGAAAGTTTGGAGCCTGGAGTCAAAGCTCTCGTCGGAAATCTGGTCCCAAAACTCCTTGAGCTGAGCTTTGTTGATAGAGTCACCACTTATATTATGCTTTCTACAAAGTCCTCGGAATAGCTCACCCGCAAATTCTTTAGACTCCTTGTTCATCCCTATGCATTCGCCGAACATCGAGCAATGAAGAAGGCCGTCGGAGGTCGTGATGGCGAGCTCGTTATACCGCTTCTCGACGGCAGGCCAGCCATTTCCGGCAGCTCCCGTCTTGGTGGTGATGAACTTGAGTCCTTTAAGAGCATGAGCTGCAGCGGATTTAGTCCTATCAAAACGCCTGCTGCTGGGTCGCCGTGTCAAGGAAGCAAAGCGTTTGAGCTCTTGAGAGACCTGCTTGATATGCGAGGAAGTGAAGGGC
这条序列的两个保守氨基酸序列分别为TKSAAAHALKGLKFITTKTGAAGNGWPAVEKRY NELAITTSDGLLHCSMFGECIGMNKESKEFAGELFRGLCRKHNISGDSINKAQLKEFWDQ ISDESFDS（blastx后对应原核苷酸序列为1966-1655）和ILKVAVYPGNALALHMSKPQGFKYKSGQYMFVNCAAVSPFEWHPFSITSSPGDDYLSVHI RTLGDWTRQLKTVFS（blastx后对应原核苷酸序列为577-353），说了也奇怪，我再ORF上搜索的时候明明是第一条氨基酸保守区在上游，第二条氨基酸保守区在下游，可不知道为什么，blastx后却发现，第一个保守区变到下游去了，而且NCBI上给的序列还是反的，是1966-1655和577-353，按道理不应该是从小到大吗？
所以我有3个问题：1、为什么应该在上游的保守序列跑到了下游？2、这个序列编号为什么是从大到小？3、就是RACE的引物设计问题了。
附上我自设计的引物

哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗
GSP - RACE.png
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1楼2015-07-03 17:51:35
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用primer3设计，非常简单，高效。我们这儿所有RACE引物基本都是用它弄的。
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日拱一卒，功不唐捐
2楼2015-07-06 11:25:20
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Crescendo at 2015-07-06 11:25:20
用primer3设计，非常简单，高效。我们这儿所有RACE引物基本都是用它弄的。

我用了pp5和oligo7，你能具体讲下吗，就是参数设置那块，谢谢你！

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3楼2015-07-07 08:47:18
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-07 08:47:18
我用了pp5和oligo7，你能具体讲下吗，就是参数设置那块，谢谢你！
...

按照RACE试剂盒手册进行啊！我们用SMART race试剂盒。
用降落pcr+巢氏pcr进行扩增。
长度：20~28bp，我一般选22~25bp,
产物长度：至少100bp（3‘和5’ 重叠区）

引物可以用DNAman进行扩增效率检测；用NCBI primer-blast进行特异性验证。

要是还不清楚，认真看看Primer3的使用手册。
http://primer3.ut.ee/
or
http://www.simgene.com/Primer3
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日拱一卒，功不唐捐
4楼2015-07-07 11:37:24
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erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

其实我觉得RACE引物只要Tm高一些，重叠的多一些就好了，RACE也就是碰运气……多试试就好了……
而且我们实验室也没用touch down pcr来跑，就是普通的pcr程序做巢式就ok，如果一直扩不出来可以考虑换酶，可能会有一些二级结构之类的造成影响。
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5楼2015-07-07 16:57:11
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by erland21411 at 2015-07-07 16:57:11
其实我觉得RACE引物只要Tm高一些，重叠的多一些就好了，RACE也就是碰运气……多试试就好了……
而且我们实验室也没用touch down pcr来跑，就是普通的pcr程序做巢式就ok，如果一直扩不出来可以考虑换酶，可能会有一 ...

可是race试剂盒那么贵，这么随便不是太浪费了吗

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6楼2015-07-08 09:18:41
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Crescendo at 2015-07-07 11:37:24
按照RACE试剂盒手册进行啊！我们用SMART race试剂盒。
用降落pcr+巢氏pcr进行扩增。
长度：20~28bp，我一般选22~25bp,
产物长度：至少100bp（3‘和5’ 重叠区）

引物可以用DNAman进行扩增效率检测；用NCBI p ...

产物100bp，那是引物对吗？然后用上游引物做3'race，用下游引物做5'race？

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7楼2015-07-08 09:24:10
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-08 09:18:41
可是race试剂盒那么贵，这么随便不是太浪费了吗
...

按照kit说明和我的经验，1个cdna模板能进行至少能做20个反应，要是20个都能扩增出来，平摊也不算贵。
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日拱一卒，功不唐捐
8楼2015-07-08 17:38:42
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
饿的神啊: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-09 09:10:46
引用回帖:
7楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-08 09:24:10
产物100bp，那是引物对吗？然后用上游引物做3'race，用下游引物做5'race？
...

对。正是这样。最好上游和下游各设计2条，
如：
F100, F200
R400, R600
巢氏pcr——
for3‘：第一轮 F100+UMP，第二轮F200+NUP
for5'：第一轮 R600+UPM，第二轮R400+NUP
说明几点：
(1)UPM、NUP序列是公开的，直接去公司合成；
pcr所用 taq酶，我们用的是extaq，效果较稳定；全氏金公司的transtaq我么也试过，也可以。
(2)不要忘记cdna合成，反转录的效率要保证。我们用BD kit提供的，单独买千元上下。你也可以买国产的，我们用百泰克的也能做出来。
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日拱一卒，功不唐捐
9楼2015-07-08 17:47:40
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erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-08 09:18:41
可是race试剂盒那么贵，这么随便不是太浪费了吗
...

我用的是clontech的试剂盒，模板合成以之后可以稀释成100ul,够用好多次了

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10楼2015-07-08 21:13:40
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