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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于takata公司的5‘RACE试剂盒中的引物设计
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zmj521good

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 关于takata公司的5‘RACE试剂盒中的引物设计

各位高手啊，请问有人用过takata公司的5‘RACE试剂盒没？用过的知不知道其中的特异性引物是不是要设计两个呀？是从哪端设计的呢？求救求救……
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1楼 2012-04-05 10:04:04
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zmj521good

铁杆木虫 (小有名气)
谢谢四楼啊，那个用primer primer 5 软件设计时有sense primer 和antisense primer，那那个3'端的特异性引物是不是就是antisense primer啊？我做的这个有部分序列，只是5'端不完整，是不是应该设计的引物离暂时这个已知部分序列的“5‘ 端”不要太远，应小于1000bp？
万分感谢！
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6楼2012-04-06 16:22:19
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xinshen0915

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+5, Good! 2012-04-05 18:38:39
我用的也是TAKARA 的5‘RACE试剂盒，一年前做的，此试剂盒是特异性扩增cDNA5'末端全长的试剂盒。具体的操作步骤是：
1、用CIAP去总RNA的5‘磷酸基团；
2、用TAP去掉mRNA的5’帽子结构，然后用T4RNA ligase将试剂盒里面的5‘RACE Adaptor连接到mrna的5’端；
3、以步骤2中得到的mRNA为模板，进行反转录，得到cDNA；
4、使用下游外侧特异性引物GSP1 和5 ′  RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应，再使用下游内侧特异性引物GSP2和5 ′  RACE Inner Primer 进行Inner PCR 反应；
5、将PCR产物纯化测序。
注：此实验中5’端接头和引物是试剂盒已有的，需要设计的只是目的基因3‘端的引物。为了提高扩增的特异性，试剂盒采用了套式 PCR法，即试剂盒里面有两条5’端引物，一个是Outer Primer，一个是Inner Primer，你自己设计的3‘端引物也最好设计两条，一条3’Outer Primer，一条3‘Inner Primer，首轮扩增使用试剂盒自带的5’Outer Primer和你自己的3’Outer Primer扩增，然后依次扩增产物为模板，以试剂盒5‘Inner Primer和自己设计的3‘Inner Primer扩增就OK了，这个实验做出来有点难度，好好看说明书，做好对照，祝你成功~
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4楼2012-04-05 16:39:51
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普通回帖

xzx018

铁杆木虫 (著名写手)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
我想问下RACE是不是就是步移PCR啊，最近我也要做这个东西
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2楼2012-04-05 10:55:24
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neu234

木虫之王 (文学泰斗)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
这个东西是做什么用的，学习一下
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3楼2012-04-05 15:33:04
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hch123

金虫 (正式写手)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
感谢三楼！！！
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5楼2012-04-06 12:58:57
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xinshen0915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zmj521good at 2012-04-06 16:22:19:
谢谢四楼啊，那个用primer primer 5 软件设计时有sense primer 和antisense primer，那那个3'端的特异性引物是不是就是antisense primer啊？我做的这个有部分序列，只是5'端不完整，是不是应该设计的引物离暂时这 ...

是的。3'端的特异性引物就是antisense primer，最好设计两条，一条3’Outer Primer，一条3‘Inner Primer，引物设计原则可以参考试剂盒说明书。
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8楼2012-04-13 19:51:28
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zcfwtyao

木虫 (正式写手)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
我也在准备做5‘race, 设计的下游的outer primer和inner primer.分别在R230，R166。该基因总长大概764bp，ORF框F67,R627.现用TAKARA 的5‘RACE试剂盒。扩5’端。设计的引物可行吗？
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9楼2013-03-06 20:21:50
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zmj521good

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zcfwtyao at 2013-03-06 20:21:50
我也在准备做5‘race, 设计的下游的outer primer和inner primer.分别在R230，R166。该基因总长大概764bp，ORF框F67,R627.现用TAKARA 的5‘RACE试剂盒。扩5’端。设计的引物可行吗？

后来用了clontech的smarter RACE试剂盒，呵呵
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10楼2013-03-08 15:34:29
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王怡青

新虫 (初入文坛)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
10楼: Originally posted by zmj521good at 2013-03-08 15:34:29
后来用了clontech的smarter RACE试剂盒，呵呵...

楼主做3RACE了吗？我的5RACE 做出来了，3RACE做不出来，用的是clontech的smarter RACE试剂盒说明书的方法，3RACE特异性引物设计是上游引物吧？为什么要和UPM一起呢？UPM不是和3‘端接头除T外一模一样吗？
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11楼2015-12-08 18:30:52
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王怡青

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zmj521good at 2012-04-06 16:22:19
谢谢四楼啊，那个用primer primer 5 软件设计时有sense primer 和antisense primer，那那个3'端的特异性引物是不是就是antisense primer啊？我做的这个有部分序列，只是5'端不完整，是不是应该设计的引物离暂时这个 ...

此处的antisense primer指的是5RACE的3’端吧？
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12楼2015-12-08 18:34:33
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竹影夏

新虫 (初入文坛)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
10楼: Originally posted by zmj521good at 2013-03-08 15:34:29
后来用了clontech的smarter RACE试剂盒，呵呵...

你好，我是新手，也正准备开始用clontech的smarter RACE试剂盒，正在看说明书，但是是英文的，有些地方看不懂。。请问楼主有中文的吗？
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13楼2016-02-27 10:12:46
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jackyoung

新虫 (正式写手)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
RACE这个东西谁做谁知道，建议你首先要尽量保证引物特异，另外尽量保证最终括增的片段不要太大（能扩多少是一回事，实际成功多少是另一回事。）

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14楼2016-02-28 00:25:36
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XOooZzz7楼
2012-04-06 17:23   回复  
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
6楼: Originally posted by zmj521good at 2012-04-06 16:22:19: 谢谢四楼啊，那个用primer primer 5 软件设计时有sense primer 和antisense primer，那那个3'端的特异性引物是不是就是antisense primer啊？我做的这个有部分序列，只是5'端不完整，是不是应该设计的引物离暂时这 ...

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