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[交流]
关于takata公司的5‘RACE试剂盒中的引物设计
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| 各位高手啊，请问有人用过takata公司的5‘RACE试剂盒没？用过的知不知道其中的特异性引物是不是要设计两个呀？是从哪端设计的呢？求救求救…… |
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6楼2012-04-06 16:22:19
2楼2012-04-05 10:55:24
3楼2012-04-05 15:33:04
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zmj521good(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+5, Good! 2012-04-05 18:38:39
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+5, Good! 2012-04-05 18:38:39
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我用的也是TAKARA 的5‘RACE试剂盒，一年前做的，此试剂盒是特异性扩增cDNA5'末端全长的试剂盒。具体的操作步骤是： 1、用CIAP去总RNA的5‘磷酸基团； 2、用TAP去掉mRNA的5’帽子结构，然后用T4RNA ligase将试剂盒里面的5‘RACE Adaptor连接到mrna的5’端； 3、以步骤2中得到的mRNA为模板，进行反转录，得到cDNA； 4、使用下游外侧特异性引物GSP1 和5 ′ RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应，再使用下游内侧特异性引物GSP2和5 ′ RACE Inner Primer 进行Inner PCR 反应； 5、将PCR产物纯化测序。 注：此实验中5’端接头和引物是试剂盒已有的，需要设计的只是目的基因3‘端的引物。为了提高扩增的特异性，试剂盒采用了套式 PCR法，即试剂盒里面有两条5’端引物，一个是Outer Primer，一个是Inner Primer，你自己设计的3‘端引物也最好设计两条，一条3’Outer Primer，一条3‘Inner Primer，首轮扩增使用试剂盒自带的5’Outer Primer和你自己的3’Outer Primer扩增，然后依次扩增产物为模板，以试剂盒5‘Inner Primer和自己设计的3‘Inner Primer扩增就OK了，这个实验做出来有点难度，好好看说明书，做好对照，祝你成功~ |
4楼2012-04-05 16:39:51
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XOooZzz7楼
2012-04-06 17:23
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zmj521good(金币+1): 谢谢参与
对