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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于takata公司的5‘RACE试剂盒中的引物设计
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zmj521good

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 关于takata公司的5‘RACE试剂盒中的引物设计

各位高手啊，请问有人用过takata公司的5‘RACE试剂盒没？用过的知不知道其中的特异性引物是不是要设计两个呀？是从哪端设计的呢？求救求救……
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1楼 2012-04-05 10:04:04
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xinshen0915

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+5, Good! 2012-04-05 18:38:39
我用的也是TAKARA 的5‘RACE试剂盒，一年前做的，此试剂盒是特异性扩增cDNA5'末端全长的试剂盒。具体的操作步骤是：
1、用CIAP去总RNA的5‘磷酸基团；
2、用TAP去掉mRNA的5’帽子结构，然后用T4RNA ligase将试剂盒里面的5‘RACE Adaptor连接到mrna的5’端；
3、以步骤2中得到的mRNA为模板，进行反转录，得到cDNA；
4、使用下游外侧特异性引物GSP1 和5 ′  RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应，再使用下游内侧特异性引物GSP2和5 ′  RACE Inner Primer 进行Inner PCR 反应；
5、将PCR产物纯化测序。
注：此实验中5’端接头和引物是试剂盒已有的，需要设计的只是目的基因3‘端的引物。为了提高扩增的特异性，试剂盒采用了套式 PCR法，即试剂盒里面有两条5’端引物，一个是Outer Primer，一个是Inner Primer，你自己设计的3‘端引物也最好设计两条，一条3’Outer Primer，一条3‘Inner Primer，首轮扩增使用试剂盒自带的5’Outer Primer和你自己的3’Outer Primer扩增，然后依次扩增产物为模板，以试剂盒5‘Inner Primer和自己设计的3‘Inner Primer扩增就OK了，这个实验做出来有点难度，好好看说明书，做好对照，祝你成功~
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4楼2012-04-05 16:39:51
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
我想问下RACE是不是就是步移PCR啊，最近我也要做这个东西
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2楼2012-04-05 10:55:24
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neu234

木虫之王 (文学泰斗)
★
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
这个东西是做什么用的，学习一下
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3楼2012-04-05 15:33:04
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zmj521good

铁杆木虫 (小有名气)
谢谢四楼啊，那个用primer primer 5 软件设计时有sense primer 和antisense primer，那那个3'端的特异性引物是不是就是antisense primer啊？我做的这个有部分序列，只是5'端不完整，是不是应该设计的引物离暂时这个已知部分序列的“5‘ 端”不要太远，应小于1000bp？
万分感谢！
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6楼2012-04-06 16:22:19
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XOooZzz7楼
2012-04-06 17:23   回复  
zmj521good(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
6楼: Originally posted by zmj521good at 2012-04-06 16:22:19: 谢谢四楼啊，那个用primer primer 5 软件设计时有sense primer 和antisense primer，那那个3'端的特异性引物是不是就是antisense primer啊？我做的这个有部分序列，只是5'端不完整，是不是应该设计的引物离暂时这 ...

对
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