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饿的神啊

新虫 (著名写手)

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[求助] 哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗已有2人参与

打算做race，试剂盒也买好了，但是在设计GSP上遇到了问题，在oligo7上单独搜索上游引物或下游引物失败（限定了在保守区内），按对搜索的时候能成功，但问题是本应该在靠近5‘端设计3’race用的forward GSP primer，在靠近3‘端设计5’race用的reverse GSP primer，按对搜索的时候就反过来了，上游引物在5‘端，下游引物在3’端。而且我看说明书上说引物3‘端的GC含量要低，3’端最末的5个碱基中G或C不得多于2个，但是我设计的没有一条能达到要求。现附上序列，请高手帮帮忙吧，感激不尽！
GCCCTTTTATGCCTTTGAACCACTCGAATGAACCTTGTTCCCTTGTCACCCAATAGAAGTATGCTTTTCTTGTATTGAATGATGAATTCTTGTTGTTGTTGTTTACTGTTAATCCTGACTCTAAATTGTTGTCTTCTGATTTCATGTTGTTGATGATGTCTTTGACTATGCTGATCATGGGAGTAGCCCCAATTCCAAGCCCCACTAGTAGCACTACATCATATTTTTTATAGTCTTGAGCTGGTGCTCCATATGGTCCGTCTATTAATATCTTTGGAAACCCTCGAGAGTTATTTTCCCTTTCTGCTCTAAGAAGACCGCTCTTCCCAGCAGGTGCAGGCTGGCAAACCTCAGAGAAAACTGTCTTAAGCTGCCTAGTCCAATCGCCCAAAGTTCGGATATGAACGCTGAGGTAGTCATCTCCTGGTGATGATGTGATGGAAAACGGATGCCATTCGAACGGTGAGACGGCAGCGCAATTTACGAACATGTACTGTCCGCTCTTGTATTTGAAGCCTTGTGGTTTTGACATGTGTAATGCCAAGGCATTTCCAGGATAAACAGCAACCTTGAGAATCTTGACAGGCTCGATGCTTGATCTCAAAGCTCTAGTCAATCTCTCACAAGCATAAAGAACCATCGGGACAGCCAGATACATCCATGTCGTCTTCTGATACCATTTCTTGGTGAGATAGAGTTTAATTCCATGGACAATGAGAGGGGTATAGACAATGATGAAAAGATGATGTGAGTACCAAAAGGCATTGAATCCAGTGAGTCTTTTAAGTGGTTTTGGCAGATTGAGCTTGTTGCGCCTGAACCAAGGCGTTGCCAAAGTGAATGCTATCACCATTAACACCACCATTATGATCCCTGTTACTCCTTCAACTCCCTTTACAAACCACCAGTAATTATCCGGTTGCTCGTCCCCAAAGTAAGGCTTCATTGGCTCGTATTCTTCTTCAGTCGCGTGGAGGAGTCGCGGGAAATCACAGGTTAGATGAGCTCCGCCGTGTAATATAACTCCAATCCCAATTCCAACCGCGATCACCTTATGGAAATTTAAGTTGTCATCGAAAGGGACAACAAGTCCTAATTTAGTTTTGTTTCTGAGCCATGTGATGGTGTTTCGGCAAACTGGTAATAATATCAAGGCCATGTTGAATTTAAGTGTCTCTGCTCCTCCTTTAGCAATGCAAACGCAATAGCCCATCACATCATAAGCAGCCTTGTTTCGGTACTGCACAAACTTGTAGGCAAATAAACCCCCGACAATTCCAAGCCACAACAGCATAATCCAAACCCTTTGCCAATTATCCATCAAAAAGTACTTAATCTTCTGATAACATTTTCGTAATGGGTTGTTTTCTTGGGTTGGCTTCAGCTTCTGGCTCAACATTTGACTCAGAATTCGACTGTCTCCTACTCTTACAGATTGATTTGGAGCTTGCAACAACAATGTTTCCAGGTTATGAATCATGATGTATCCGGCATTGTCAGGGTCTAATTCTTCCATAATCATGGCTGCATATTCCTCTGCTTGTTTCTGAATGTTGGAGAGCTTGTTTGCAGAAGCACTCAGACTAATAATCTCTTTGACTTCTTCTTCAGTGATTCTTCCATCAGCGTCTGTGTCGACCATGTCAAAGAAAGTTTGGAGCCTGGAGTCAAAGCTCTCGTCGGAAATCTGGTCCCAAAACTCCTTGAGCTGAGCTTTGTTGATAGAGTCACCACTTATATTATGCTTTCTACAAAGTCCTCGGAATAGCTCACCCGCAAATTCTTTAGACTCCTTGTTCATCCCTATGCATTCGCCGAACATCGAGCAATGAAGAAGGCCGTCGGAGGTCGTGATGGCGAGCTCGTTATACCGCTTCTCGACGGCAGGCCAGCCATTTCCGGCAGCTCCCGTCTTGGTGGTGATGAACTTGAGTCCTTTAAGAGCATGAGCTGCAGCGGATTTAGTCCTATCAAAACGCCTGCTGCTGGGTCGCCGTGTCAAGGAAGCAAAGCGTTTGAGCTCTTGAGAGACCTGCTTGATATGCGAGGAAGTGAAGGGC
这条序列的两个保守氨基酸序列分别为TKSAAAHALKGLKFITTKTGAAGNGWPAVEKRY NELAITTSDGLLHCSMFGECIGMNKESKEFAGELFRGLCRKHNISGDSINKAQLKEFWDQ ISDESFDS（blastx后对应原核苷酸序列为1966-1655）和ILKVAVYPGNALALHMSKPQGFKYKSGQYMFVNCAAVSPFEWHPFSITSSPGDDYLSVHI RTLGDWTRQLKTVFS（blastx后对应原核苷酸序列为577-353），说了也奇怪，我再ORF上搜索的时候明明是第一条氨基酸保守区在上游，第二条氨基酸保守区在下游，可不知道为什么，blastx后却发现，第一个保守区变到下游去了，而且NCBI上给的序列还是反的，是1966-1655和577-353，按道理不应该是从小到大吗？
所以我有3个问题：1、为什么应该在上游的保守序列跑到了下游？2、这个序列编号为什么是从大到小？3、就是RACE的引物设计问题了。
附上我自设计的引物

GSP - RACE.png

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1楼2015-07-03 17:51:35

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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

3楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-07 08:47:18
我用了pp5和oligo7，你能具体讲下吗，就是参数设置那块，谢谢你！
...

按照RACE试剂盒手册进行啊！我们用SMART race试剂盒。
用降落pcr+巢氏pcr进行扩增。
长度：20~28bp，我一般选22~25bp,
产物长度：至少100bp（3‘和5’ 重叠区）

引物可以用DNAman进行扩增效率检测；用NCBI primer-blast进行特异性验证。

要是还不清楚，认真看看Primer3的使用手册。
http://primer3.ut.ee/
or
http://www.simgene.com/Primer3