应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
191/2返回列表12下一页
查看: 3171  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

饿的神啊

新虫 (著名写手)

[求助] 哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗 已有2人参与

打算做race，试剂盒也买好了，但是在设计GSP上遇到了问题，在oligo7上单独搜索上游引物或下游引物失败（限定了在保守区内），按对搜索的时候能成功，但问题是本应该在靠近5‘端设计3’race用的forward GSP primer，在靠近3‘端设计5’race用的reverse GSP primer，按对搜索的时候就反过来了，上游引物在5‘端，下游引物在3’端。而且我看说明书上说引物3‘端的GC含量要低，3’端最末的5个碱基中G或C不得多于2个，但是我设计的没有一条能达到要求。现附上序列，请高手帮帮忙吧，感激不尽！
GCCCTTTTATGCCTTTGAACCACTCGAATGAACCTTGTTCCCTTGTCACCCAATAGAAGTATGCTTTTCTTGTATTGAATGATGAATTCTTGTTGTTGTTGTTTACTGTTAATCCTGACTCTAAATTGTTGTCTTCTGATTTCATGTTGTTGATGATGTCTTTGACTATGCTGATCATGGGAGTAGCCCCAATTCCAAGCCCCACTAGTAGCACTACATCATATTTTTTATAGTCTTGAGCTGGTGCTCCATATGGTCCGTCTATTAATATCTTTGGAAACCCTCGAGAGTTATTTTCCCTTTCTGCTCTAAGAAGACCGCTCTTCCCAGCAGGTGCAGGCTGGCAAACCTCAGAGAAAACTGTCTTAAGCTGCCTAGTCCAATCGCCCAAAGTTCGGATATGAACGCTGAGGTAGTCATCTCCTGGTGATGATGTGATGGAAAACGGATGCCATTCGAACGGTGAGACGGCAGCGCAATTTACGAACATGTACTGTCCGCTCTTGTATTTGAAGCCTTGTGGTTTTGACATGTGTAATGCCAAGGCATTTCCAGGATAAACAGCAACCTTGAGAATCTTGACAGGCTCGATGCTTGATCTCAAAGCTCTAGTCAATCTCTCACAAGCATAAAGAACCATCGGGACAGCCAGATACATCCATGTCGTCTTCTGATACCATTTCTTGGTGAGATAGAGTTTAATTCCATGGACAATGAGAGGGGTATAGACAATGATGAAAAGATGATGTGAGTACCAAAAGGCATTGAATCCAGTGAGTCTTTTAAGTGGTTTTGGCAGATTGAGCTTGTTGCGCCTGAACCAAGGCGTTGCCAAAGTGAATGCTATCACCATTAACACCACCATTATGATCCCTGTTACTCCTTCAACTCCCTTTACAAACCACCAGTAATTATCCGGTTGCTCGTCCCCAAAGTAAGGCTTCATTGGCTCGTATTCTTCTTCAGTCGCGTGGAGGAGTCGCGGGAAATCACAGGTTAGATGAGCTCCGCCGTGTAATATAACTCCAATCCCAATTCCAACCGCGATCACCTTATGGAAATTTAAGTTGTCATCGAAAGGGACAACAAGTCCTAATTTAGTTTTGTTTCTGAGCCATGTGATGGTGTTTCGGCAAACTGGTAATAATATCAAGGCCATGTTGAATTTAAGTGTCTCTGCTCCTCCTTTAGCAATGCAAACGCAATAGCCCATCACATCATAAGCAGCCTTGTTTCGGTACTGCACAAACTTGTAGGCAAATAAACCCCCGACAATTCCAAGCCACAACAGCATAATCCAAACCCTTTGCCAATTATCCATCAAAAAGTACTTAATCTTCTGATAACATTTTCGTAATGGGTTGTTTTCTTGGGTTGGCTTCAGCTTCTGGCTCAACATTTGACTCAGAATTCGACTGTCTCCTACTCTTACAGATTGATTTGGAGCTTGCAACAACAATGTTTCCAGGTTATGAATCATGATGTATCCGGCATTGTCAGGGTCTAATTCTTCCATAATCATGGCTGCATATTCCTCTGCTTGTTTCTGAATGTTGGAGAGCTTGTTTGCAGAAGCACTCAGACTAATAATCTCTTTGACTTCTTCTTCAGTGATTCTTCCATCAGCGTCTGTGTCGACCATGTCAAAGAAAGTTTGGAGCCTGGAGTCAAAGCTCTCGTCGGAAATCTGGTCCCAAAACTCCTTGAGCTGAGCTTTGTTGATAGAGTCACCACTTATATTATGCTTTCTACAAAGTCCTCGGAATAGCTCACCCGCAAATTCTTTAGACTCCTTGTTCATCCCTATGCATTCGCCGAACATCGAGCAATGAAGAAGGCCGTCGGAGGTCGTGATGGCGAGCTCGTTATACCGCTTCTCGACGGCAGGCCAGCCATTTCCGGCAGCTCCCGTCTTGGTGGTGATGAACTTGAGTCCTTTAAGAGCATGAGCTGCAGCGGATTTAGTCCTATCAAAACGCCTGCTGCTGGGTCGCCGTGTCAAGGAAGCAAAGCGTTTGAGCTCTTGAGAGACCTGCTTGATATGCGAGGAAGTGAAGGGC
这条序列的两个保守氨基酸序列分别为TKSAAAHALKGLKFITTKTGAAGNGWPAVEKRY NELAITTSDGLLHCSMFGECIGMNKESKEFAGELFRGLCRKHNISGDSINKAQLKEFWDQ ISDESFDS（blastx后对应原核苷酸序列为1966-1655）和ILKVAVYPGNALALHMSKPQGFKYKSGQYMFVNCAAVSPFEWHPFSITSSPGDDYLSVHI RTLGDWTRQLKTVFS（blastx后对应原核苷酸序列为577-353），说了也奇怪，我再ORF上搜索的时候明明是第一条氨基酸保守区在上游，第二条氨基酸保守区在下游，可不知道为什么，blastx后却发现，第一个保守区变到下游去了，而且NCBI上给的序列还是反的，是1966-1655和577-353，按道理不应该是从小到大吗？
所以我有3个问题：1、为什么应该在上游的保守序列跑到了下游？2、这个序列编号为什么是从大到小？3、就是RACE的引物设计问题了。
附上我自设计的引物

哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗
GSP - RACE.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-07-03 17:51:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用primer3设计，非常简单，高效。我们这儿所有RACE引物基本都是用它弄的。
赞一下 回复此楼
日拱一卒，功不唐捐
2楼2015-07-06 11:25:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Crescendo at 2015-07-06 11:25:20
用primer3设计，非常简单，高效。我们这儿所有RACE引物基本都是用它弄的。

我用了pp5和oligo7，你能具体讲下吗，就是参数设置那块，谢谢你！

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2015-07-07 08:47:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-07 08:47:18
我用了pp5和oligo7，你能具体讲下吗，就是参数设置那块，谢谢你！
...

按照RACE试剂盒手册进行啊！我们用SMART race试剂盒。
用降落pcr+巢氏pcr进行扩增。
长度：20~28bp，我一般选22~25bp,
产物长度：至少100bp（3‘和5’ 重叠区）

引物可以用DNAman进行扩增效率检测；用NCBI primer-blast进行特异性验证。

要是还不清楚，认真看看Primer3的使用手册。
http://primer3.ut.ee/
or
http://www.simgene.com/Primer3
赞一下 回复此楼
日拱一卒，功不唐捐
4楼2015-07-07 11:37:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

其实我觉得RACE引物只要Tm高一些，重叠的多一些就好了，RACE也就是碰运气……多试试就好了……
而且我们实验室也没用touch down pcr来跑，就是普通的pcr程序做巢式就ok，如果一直扩不出来可以考虑换酶，可能会有一些二级结构之类的造成影响。
赞一下 回复此楼
5楼2015-07-07 16:57:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by erland21411 at 2015-07-07 16:57:11
其实我觉得RACE引物只要Tm高一些，重叠的多一些就好了，RACE也就是碰运气……多试试就好了……
而且我们实验室也没用touch down pcr来跑，就是普通的pcr程序做巢式就ok，如果一直扩不出来可以考虑换酶，可能会有一 ...

可是race试剂盒那么贵，这么随便不是太浪费了吗

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2015-07-08 09:18:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Crescendo at 2015-07-07 11:37:24
按照RACE试剂盒手册进行啊！我们用SMART race试剂盒。
用降落pcr+巢氏pcr进行扩增。
长度：20~28bp，我一般选22~25bp,
产物长度：至少100bp（3‘和5’ 重叠区）

引物可以用DNAman进行扩增效率检测；用NCBI p ...

产物100bp，那是引物对吗？然后用上游引物做3'race，用下游引物做5'race？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2015-07-08 09:24:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-08 09:18:41
可是race试剂盒那么贵，这么随便不是太浪费了吗
...

按照kit说明和我的经验，1个cdna模板能进行至少能做20个反应，要是20个都能扩增出来，平摊也不算贵。
赞一下 回复此楼
日拱一卒，功不唐捐
8楼2015-07-08 17:38:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
饿的神啊: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-09 09:10:46
引用回帖:
7楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-08 09:24:10
产物100bp，那是引物对吗？然后用上游引物做3'race，用下游引物做5'race？
...

对。正是这样。最好上游和下游各设计2条，
如：
F100, F200
R400, R600
巢氏pcr——
for3‘：第一轮 F100+UMP，第二轮F200+NUP
for5'：第一轮 R600+UPM，第二轮R400+NUP
说明几点：
(1)UPM、NUP序列是公开的，直接去公司合成；
pcr所用 taq酶，我们用的是extaq，效果较稳定；全氏金公司的transtaq我么也试过，也可以。
(2)不要忘记cdna合成，反转录的效率要保证。我们用BD kit提供的，单独买千元上下。你也可以买国产的，我们用百泰克的也能做出来。
赞一下 回复此楼
日拱一卒，功不唐捐
9楼2015-07-08 17:47:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-08 09:18:41
可是race试剂盒那么贵，这么随便不是太浪费了吗
...

我用的是clontech的试剂盒，模板合成以之后可以稀释成100ul,够用好多次了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
10楼2015-07-08 21:13:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 饿的神啊 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 318求调剂，计算材料方向 +7 吸喵有害笙命 2026-04-01 8/400 2026-04-01 23:54 by 义文wang
[考研] 085600 295分求调剂 +15 W55j 2026-03-30 18/900 2026-04-01 23:00 by 来看流星雨10
[考研] 11408 321分求调剂 +3 huchun12138 2026-03-30 4/200 2026-04-01 22:48 by guanxin1001
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +12 hanamiko 2026-03-27 12/600 2026-04-01 22:34 by 运气yunqi
[考研] 085602化学工程268分蹲调剂 +8 月照花林。 2026-04-01 8/400 2026-04-01 22:08 by 无际的草原
[考研] 324分 085600材料与化工 +17 呆鹅oor 2026-03-27 17/850 2026-04-01 17:51 by JYD2011
[考研] 330分求调剂 +11 qzenlc 2026-03-29 11/550 2026-04-01 14:32 by chenqifeng666
[考研] 336求调剂 +3 kiyy 2026-04-01 3/150 2026-04-01 12:46 by wxiongid
[考研] 0856调剂 +7 曲听筠 2026-03-30 7/350 2026-04-01 08:51 by JourneyLucky
[考研] 考研生物与医药调剂 +7 铁憨憨123425 2026-03-31 7/350 2026-04-01 08:45 by JourneyLucky
[考研] 322求调剂 +4 熹僖XX 2026-03-31 4/200 2026-04-01 08:21 by JourneyLucky
[考研] 本2一志愿C9-333分，材料科学与工程，求调剂 +9 升升不降 2026-03-31 9/450 2026-03-31 18:01 by 无际的草原
[考研] 江苏苏北高校诚邀调剂同学 +3 zzll406 2026-03-31 3/150 2026-03-31 16:54 by 及时行乐fan
[考研] 本科211生物医学工程085409求调剂339分 +7 里子木yy 2026-03-29 7/350 2026-03-31 14:35 by fmesaito
[考研] 南京大学化学调剂 +11 景随风 2026-03-29 16/800 2026-03-31 10:14 by herarysara
[考研] 求调剂，一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕 +6 @taotao 2026-03-26 7/350 2026-03-30 10:43 by 我是小康
[考研] 一志愿北京工业大学，324分求调剂 +6 零八# 2026-03-28 6/300 2026-03-29 21:20 by nanaliuyun
[考研] 298求调剂 +3 种圣赐 2026-03-29 3/150 2026-03-29 12:06 by longlotian
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +6 崔wj 2026-03-26 6/300 2026-03-29 01:11 by hanserlol
[考研] 081200-314 +3 LILIQQ 2026-03-27 4/200 2026-03-28 09:41 by 保护地球你我做�
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭