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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Crescendo at 2015-07-08 17:47:40
对。正是这样。最好上游和下游各设计2条，
如：
F100, F200
R400, R600
巢氏pcr——
for3‘：第一轮 F100+UMP，第二轮F200+NUP
for5'：第一轮 R600+UPM，第二轮R400+NUP
说明几点：
(1)UPM、NUP序列是公开 ...

好的，谢谢你，照这样的话是不是不用强求引物对靠近cDNA末端？对于引物只要求TM值尽量高，别的都可以将就吗？

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11楼2015-07-09 09:12:30
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Crescendo at 2015-07-08 17:38:42
按照kit说明和我的经验，1个cdna模板能进行至少能做20个反应，要是20个都能扩增出来，平摊也不算贵。...

但是如果引物不好，是不是就浪费了一次，我买的introvigen的试剂盒，近7000做6次，其中一次是对照

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12楼2015-07-09 09:14:33
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by erland21411 at 2015-07-08 21:13:40
我用的是clontech的试剂盒，模板合成以之后可以稀释成100ul,够用好多次了
...

那也得引物对，能合成出来才能扩增出来吧

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13楼2015-07-09 09:17:20
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-07-09 09:12:30
好的，谢谢你，照这样的话是不是不用强求引物对靠近cDNA末端？对于引物只要求TM值尽量高，别的都可以将就吗？
...

引物设计就按照一般情况下引物的设计原则；试剂盒说明书也应该有的。
没看到过引物非得靠近或不靠近末端的说法。我试过，引物可以位于UTR。
对扩增5’时，个人认为gsp设计应该靠近5‘。
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日拱一卒，功不唐捐
14楼2015-07-09 09:24:39
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Look_2014

金虫 (小有名气)
ncbi上的序列都是从5'端到3'端数字逐渐增大，你对比的结果是数字越来越小可能是你的序列是ncbi数据库存储的序列的互补链上的序列，你把你的序列反向互补一下再去比对，应该数字就会从小到大了

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饿的神啊
Look
15楼2015-07-09 10:48:50
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by Look_2014 at 2015-07-09 10:48:50
ncbi上的序列都是从5'端到3'端数字逐渐增大，你对比的结果是数字越来越小可能是你的序列是ncbi数据库存储的序列的互补链上的序列，你把你的序列反向互补一下再去比对，应该数字就会从小到大了
...

好的，谢谢你

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16楼2015-07-10 09:06:00
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源子不二

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Crescendo at 2015-07-08 17:47:40
对。正是这样。最好上游和下游各设计2条，
如：
F100, F200
R400, R600
巢氏pcr——
for3‘：第一轮 F100+UMP，第二轮F200+NUP
for5'：第一轮 R600+UPM，第二轮R400+NUP
说明几点：
(1)UPM、NUP序列是公开 ...

你好 我用的正是你在帖子里回复的方法  扩出来的5‘端比同科物种总是少50bp  能在5端检测到NUP。请问这种情况是说明确实已经扩增到头，还是在合成cdna时就有降解，导致缺少50bp呢？还是有其他情况？请赐教，谢谢！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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17楼2015-12-22 11:32:32
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 源子不二 at 2015-12-22 11:32:32
你好 我用的正是你在帖子里回复的方法  扩出来的5‘端比同科物种总是少50bp  能在5端检测到NUP。请问这种情况是说明确实已经扩增到头，还是在合成cdna时就有降解，导致缺少50bp呢？还是有其他情况？请赐教，谢谢！
...

我认为是“已经扩增到头”。但是你还需要5'/3'拼接一下再设计能扩增跨UTR的引物PCR验证一下。
祝好
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日拱一卒，功不唐捐
18楼2015-12-22 17:31:39
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会思考的大鹅

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Crescendo at 2015-07-06 11:25:20
用primer3设计，非常简单，高效。我们这儿所有RACE引物基本都是用它弄的。

你好，我不太明白3‘RACE引物设计这一块，我已知了一段CDNA的序列，那么3‘RACE设计的引物是应该与已知cDNA序列互补的并且靠近它的5’端对吗？我是新人，还望指点一下啊~~~
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19楼2017-02-23 09:37:24
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