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饿的神啊新虫 (著名写手)
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[求助]
哪位战友能帮我设计一下RACE用的GSP引物吗 已有2人参与
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打算做race，试剂盒也买好了，但是在设计GSP上遇到了问题，在oligo7上单独搜索上游引物或下游引物失败（限定了在保守区内），按对搜索的时候能成功，但问题是本应该在靠近5‘端设计3’race用的forward GSP primer，在靠近3‘端设计5’race用的reverse GSP primer，按对搜索的时候就反过来了，上游引物在5‘端，下游引物在3’端。而且我看说明书上说引物3‘端的GC含量要低，3’端最末的5个碱基中G或C不得多于2个，但是我设计的没有一条能达到要求。现附上序列，请高手帮帮忙吧，感激不尽！ GCCCTTTTATGCCTTTGAACCACTCGAATGAACCTTGTTCCCTTGTCACCCAATAGAAGTATGCTTTTCTTGTATTGAATGATGAATTCTTGTTGTTGTTGTTTACTGTTAATCCTGACTCTAAATTGTTGTCTTCTGATTTCATGTTGTTGATGATGTCTTTGACTATGCTGATCATGGGAGTAGCCCCAATTCCAAGCCCCACTAGTAGCACTACATCATATTTTTTATAGTCTTGAGCTGGTGCTCCATATGGTCCGTCTATTAATATCTTTGGAAACCCTCGAGAGTTATTTTCCCTTTCTGCTCTAAGAAGACCGCTCTTCCCAGCAGGTGCAGGCTGGCAAACCTCAGAGAAAACTGTCTTAAGCTGCCTAGTCCAATCGCCCAAAGTTCGGATATGAACGCTGAGGTAGTCATCTCCTGGTGATGATGTGATGGAAAACGGATGCCATTCGAACGGTGAGACGGCAGCGCAATTTACGAACATGTACTGTCCGCTCTTGTATTTGAAGCCTTGTGGTTTTGACATGTGTAATGCCAAGGCATTTCCAGGATAAACAGCAACCTTGAGAATCTTGACAGGCTCGATGCTTGATCTCAAAGCTCTAGTCAATCTCTCACAAGCATAAAGAACCATCGGGACAGCCAGATACATCCATGTCGTCTTCTGATACCATTTCTTGGTGAGATAGAGTTTAATTCCATGGACAATGAGAGGGGTATAGACAATGATGAAAAGATGATGTGAGTACCAAAAGGCATTGAATCCAGTGAGTCTTTTAAGTGGTTTTGGCAGATTGAGCTTGTTGCGCCTGAACCAAGGCGTTGCCAAAGTGAATGCTATCACCATTAACACCACCATTATGATCCCTGTTACTCCTTCAACTCCCTTTACAAACCACCAGTAATTATCCGGTTGCTCGTCCCCAAAGTAAGGCTTCATTGGCTCGTATTCTTCTTCAGTCGCGTGGAGGAGTCGCGGGAAATCACAGGTTAGATGAGCTCCGCCGTGTAATATAACTCCAATCCCAATTCCAACCGCGATCACCTTATGGAAATTTAAGTTGTCATCGAAAGGGACAACAAGTCCTAATTTAGTTTTGTTTCTGAGCCATGTGATGGTGTTTCGGCAAACTGGTAATAATATCAAGGCCATGTTGAATTTAAGTGTCTCTGCTCCTCCTTTAGCAATGCAAACGCAATAGCCCATCACATCATAAGCAGCCTTGTTTCGGTACTGCACAAACTTGTAGGCAAATAAACCCCCGACAATTCCAAGCCACAACAGCATAATCCAAACCCTTTGCCAATTATCCATCAAAAAGTACTTAATCTTCTGATAACATTTTCGTAATGGGTTGTTTTCTTGGGTTGGCTTCAGCTTCTGGCTCAACATTTGACTCAGAATTCGACTGTCTCCTACTCTTACAGATTGATTTGGAGCTTGCAACAACAATGTTTCCAGGTTATGAATCATGATGTATCCGGCATTGTCAGGGTCTAATTCTTCCATAATCATGGCTGCATATTCCTCTGCTTGTTTCTGAATGTTGGAGAGCTTGTTTGCAGAAGCACTCAGACTAATAATCTCTTTGACTTCTTCTTCAGTGATTCTTCCATCAGCGTCTGTGTCGACCATGTCAAAGAAAGTTTGGAGCCTGGAGTCAAAGCTCTCGTCGGAAATCTGGTCCCAAAACTCCTTGAGCTGAGCTTTGTTGATAGAGTCACCACTTATATTATGCTTTCTACAAAGTCCTCGGAATAGCTCACCCGCAAATTCTTTAGACTCCTTGTTCATCCCTATGCATTCGCCGAACATCGAGCAATGAAGAAGGCCGTCGGAGGTCGTGATGGCGAGCTCGTTATACCGCTTCTCGACGGCAGGCCAGCCATTTCCGGCAGCTCCCGTCTTGGTGGTGATGAACTTGAGTCCTTTAAGAGCATGAGCTGCAGCGGATTTAGTCCTATCAAAACGCCTGCTGCTGGGTCGCCGTGTCAAGGAAGCAAAGCGTTTGAGCTCTTGAGAGACCTGCTTGATATGCGAGGAAGTGAAGGGC 这条序列的两个保守氨基酸序列分别为TKSAAAHALKGLKFITTKTGAAGNGWPAVEKRY NELAITTSDGLLHCSMFGECIGMNKESKEFAGELFRGLCRKHNISGDSINKAQLKEFWDQ ISDESFDS（blastx后对应原核苷酸序列为1966-1655）和ILKVAVYPGNALALHMSKPQGFKYKSGQYMFVNCAAVSPFEWHPFSITSSPGDDYLSVHI RTLGDWTRQLKTVFS（blastx后对应原核苷酸序列为577-353），说了也奇怪，我再ORF上搜索的时候明明是第一条氨基酸保守区在上游，第二条氨基酸保守区在下游，可不知道为什么，blastx后却发现，第一个保守区变到下游去了，而且NCBI上给的序列还是反的，是1966-1655和577-353，按道理不应该是从小到大吗？ 所以我有3个问题：1、为什么应该在上游的保守序列跑到了下游？2、这个序列编号为什么是从大到小？3、就是RACE的引物设计问题了。 附上我自设计的引物  GSP - RACE.png |
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【答案】应助回帖
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饿的神啊: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-09 09:10:46
饿的神啊: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-09 09:10:46
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对。正是这样。最好上游和下游各设计2条， 如： F100, F200 R400, R600 巢氏pcr—— for3‘：第一轮 F100+UMP，第二轮F200+NUP for5'：第一轮 R600+UPM，第二轮R400+NUP 说明几点： (1)UPM、NUP序列是公开的，直接去公司合成； pcr所用 taq酶，我们用的是extaq，效果较稳定；全氏金公司的transtaq我么也试过，也可以。 (2)不要忘记cdna合成，反转录的效率要保证。我们用BD kit提供的，单独买千元上下。你也可以买国产的，我们用百泰克的也能做出来。 |
9楼2015-07-08 17:47:40
2楼2015-07-06 11:25:20
饿的神啊
新虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 5982.7
- 散金: 122
- 帖子: 1004
- 在线: 66.3小时
- 虫号: 2477988
- 注册: 2013-05-23
- 性别: MM
- 专业: 植物病理学
3楼2015-07-07 08:47:18
【答案】应助回帖
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按照RACE试剂盒手册进行啊！我们用SMART race试剂盒。 用降落pcr+巢氏pcr进行扩增。 长度：20~28bp，我一般选22~25bp, 产物长度：至少100bp（3‘和5’ 重叠区） 引物可以用DNAman进行扩增效率检测；用NCBI primer-blast进行特异性验证。 要是还不清楚，认真看看Primer3的使用手册。 http://primer3.ut.ee/ or http://www.simgene.com/Primer3 |
4楼2015-07-07 11:37:24
