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mtyx

银虫 (小有名气)

[求助] 裂解液提蛋白 已有4人参与

我用裂解液提蛋白,离心后,说是取上清液,可是我离心后,不分层也没有沉淀,我想问一下是什么原因啊
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蛋白表达纯化与检测

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sageyaya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你提的是什么蛋白呢?细胞还是组织?多少量对应了多少裂解液呢?是不是加的太少了,没有完全裂解呢。
2楼2015-06-27 16:39:33
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
mtyx: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-06-27 21:22:09
楼主提的样品是什么,细胞还是组织,如果是细胞的话,放入裂解液后将细胞团吹散,冰上裂解30min,12000rpm,4度离心15min取上清即可,如果是组织的话要先将组织样本冰上磨碎,可以匀浆,也可以液氮研磨,之后加裂解液冰上裂解30min,之后的步骤是一样的。裂解液中记得加入蛋白酶抑制剂,冰上裂解中间可以混匀几次。祝好~~
3楼2015-06-27 17:59:43
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mtyx

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 504775490 at 2015-06-27 17:59:43
楼主提的样品是什么,细胞还是组织,如果是细胞的话,放入裂解液后将细胞团吹散,冰上裂解30min,12000rpm,4度离心15min取上清即可,如果是组织的话要先将组织样本冰上磨碎,可以匀浆,也可以液氮研磨,之后加裂解 ...

是细胞,12孔板,每孔加入100ul的裂解液
4楼2015-06-29 11:02:26
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
mtyx: 金币+1, 有帮助 2015-06-30 08:47:12
引用回帖:
4楼: Originally posted by mtyx at 2015-06-29 11:02:26
是细胞,12孔板,每孔加入100ul的裂解液...

哇,我提蛋白用六孔板都嫌小,你居然用12孔板,还每孔100ul裂解液,估计蛋白浓度超低,建议6cm皿或者10cm皿养细胞。
5楼2015-06-29 14:40:37
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
mtyx: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-06-30 08:46:59
引用回帖:
4楼: Originally posted by mtyx at 2015-06-29 11:02:26
是细胞,12孔板,每孔加入100ul的裂解液...

后续做WB的话,这点细胞有点点少的样子,建议用一小瓶长满的细胞或者一个皿的细胞量来提取细胞。如果细胞珍贵可以用6孔板,先将培养基弃掉,用PBS漂洗2~3次,加入200ul裂解液,或者直接加入1X上样缓冲液,用细胞刮刮下细胞,吸入到1.5ml EP管中煮沸5min后进行电泳。细胞较少的话导致蛋白浓度过低,有些低丰度的目的蛋白在做WB检测时有可能检测不到,导致白板。祝好~~~
6楼2015-06-29 16:29:06
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 504775490 at 2015-06-29 16:29:06
后续做WB的话,这点细胞有点点少的样子,建议用一小瓶长满的细胞或者一个皿的细胞量来提取细胞。如果细胞珍贵可以用6孔板,先将培养基弃掉,用PBS漂洗2~3次,加入200ul裂解液,或者直接加入1X上样缓冲液,用细胞刮 ...

你的意思是说PBS漂洗过之后直接加上样缓冲液,然后用细胞刮刮下来?我做的膜蛋白,WB效果一直不好,条带曝不出来,怀疑提取时候出现问题或者抗体的问题。
7楼2015-06-30 15:21:20
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yanjunyan

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


mtyx: 金币+1, 有帮助 2015-06-30 21:10:36
我一般用6cm皿,裂解液其中蛋白酶抑制剂含量为百分之一,加入80-110微升,具体要看细胞密度了。裂解液要覆盖在细胞上,冰上裂解15min,其实4度冰箱我也用过,不影响。然后用细胞刮刮取细胞,收集于EP管种,4度1500rpm离心15min,小心吸取上清即可。

[ 发自小木虫客户端 ]
在平淡中给自己一个动力,在昂扬中留给自己一份淡泊,在匆忙中让心灵得到释放,在喧闹中找寻一片宁静的天空。
8楼2015-06-30 16:00:38
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-06-30 15:21:20
你的意思是说PBS漂洗过之后直接加上样缓冲液,然后用细胞刮刮下来?我做的膜蛋白,WB效果一直不好,条带曝不出来,怀疑提取时候出现问题或者抗体的问题。...

楼主理解的没错,1X上样缓冲液中含有SDS可以使细胞蛋白变性,后续煮沸时,高温可使细胞破碎,使蛋白释放出来,这种方法没问题,我自己这样做过。如果怀疑蛋白提的不好,可以选择用专门的试剂盒或者专门的裂解液。另外楼主做膜蛋白要选择该蛋白表达丰度较高的细胞系进行实验,可以试试细胞量增多,裂解液体积减少,使蛋白浓度增大,可能会使目的蛋白浓度增大。不过一般蛋白提取问题不大,另外一抗的选择很重要,有的抗体是真心做不出来结果。祝好~~
9楼2015-06-30 20:37:15
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