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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 裂解液提蛋白
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mtyx

银虫 (小有名气)

[求助] 裂解液提蛋白 已有4人参与

我用裂解液提蛋白，离心后，说是取上清液，可是我离心后，不分层也没有沉淀，我想问一下是什么原因啊
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1楼 2015-06-27 10:45:41
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sageyaya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你提的是什么蛋白呢？细胞还是组织？多少量对应了多少裂解液呢？是不是加的太少了，没有完全裂解呢。
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2楼2015-06-27 16:39:33
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mtyx: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-06-27 21:22:09
楼主提的样品是什么，细胞还是组织，如果是细胞的话，放入裂解液后将细胞团吹散，冰上裂解30min，12000rpm，4度离心15min取上清即可，如果是组织的话要先将组织样本冰上磨碎，可以匀浆，也可以液氮研磨，之后加裂解液冰上裂解30min，之后的步骤是一样的。裂解液中记得加入蛋白酶抑制剂，冰上裂解中间可以混匀几次。祝好~~
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3楼2015-06-27 17:59:43
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mtyx

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 504775490 at 2015-06-27 17:59:43
楼主提的样品是什么，细胞还是组织，如果是细胞的话，放入裂解液后将细胞团吹散，冰上裂解30min，12000rpm，4度离心15min取上清即可，如果是组织的话要先将组织样本冰上磨碎，可以匀浆，也可以液氮研磨，之后加裂解 ...

是细胞，12孔板，每孔加入100ul的裂解液
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4楼2015-06-29 11:02:26
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
mtyx: 金币+1, ★有帮助 2015-06-30 08:47:12
引用回帖:
4楼: Originally posted by mtyx at 2015-06-29 11:02:26
是细胞，12孔板，每孔加入100ul的裂解液...

哇，我提蛋白用六孔板都嫌小，你居然用12孔板，还每孔100ul裂解液，估计蛋白浓度超低，建议6cm皿或者10cm皿养细胞。
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5楼2015-06-29 14:40:37
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
mtyx: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-06-30 08:46:59
引用回帖:
4楼: Originally posted by mtyx at 2015-06-29 11:02:26
是细胞，12孔板，每孔加入100ul的裂解液...

后续做WB的话，这点细胞有点点少的样子，建议用一小瓶长满的细胞或者一个皿的细胞量来提取细胞。如果细胞珍贵可以用6孔板，先将培养基弃掉，用PBS漂洗2~3次，加入200ul裂解液，或者直接加入1X上样缓冲液，用细胞刮刮下细胞，吸入到1.5ml EP管中煮沸5min后进行电泳。细胞较少的话导致蛋白浓度过低，有些低丰度的目的蛋白在做WB检测时有可能检测不到，导致白板。祝好~~~
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6楼2015-06-29 16:29:06
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 504775490 at 2015-06-29 16:29:06
后续做WB的话，这点细胞有点点少的样子，建议用一小瓶长满的细胞或者一个皿的细胞量来提取细胞。如果细胞珍贵可以用6孔板，先将培养基弃掉，用PBS漂洗2~3次，加入200ul裂解液，或者直接加入1X上样缓冲液，用细胞刮 ...

你的意思是说PBS漂洗过之后直接加上样缓冲液，然后用细胞刮刮下来？我做的膜蛋白，WB效果一直不好，条带曝不出来，怀疑提取时候出现问题或者抗体的问题。
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7楼2015-06-30 15:21:20
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yanjunyan

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
mtyx: 金币+1, ★有帮助 2015-06-30 21:10:36
我一般用6cm皿，裂解液其中蛋白酶抑制剂含量为百分之一，加入80-110微升，具体要看细胞密度了。裂解液要覆盖在细胞上，冰上裂解15min，其实4度冰箱我也用过，不影响。然后用细胞刮刮取细胞，收集于EP管种，4度1500rpm离心15min，小心吸取上清即可。

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在平淡中给自己一个动力，在昂扬中留给自己一份淡泊，在匆忙中让心灵得到释放，在喧闹中找寻一片宁静的天空。
8楼2015-06-30 16:00:38
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-06-30 15:21:20
你的意思是说PBS漂洗过之后直接加上样缓冲液，然后用细胞刮刮下来？我做的膜蛋白，WB效果一直不好，条带曝不出来，怀疑提取时候出现问题或者抗体的问题。...

楼主理解的没错，1X上样缓冲液中含有SDS可以使细胞蛋白变性，后续煮沸时，高温可使细胞破碎，使蛋白释放出来，这种方法没问题，我自己这样做过。如果怀疑蛋白提的不好，可以选择用专门的试剂盒或者专门的裂解液。另外楼主做膜蛋白要选择该蛋白表达丰度较高的细胞系进行实验，可以试试细胞量增多，裂解液体积减少，使蛋白浓度增大，可能会使目的蛋白浓度增大。不过一般蛋白提取问题不大，另外一抗的选择很重要，有的抗体是真心做不出来结果。祝好~~
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9楼2015-06-30 20:37:15
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