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mtyx

银虫 (小有名气)

[求助] 裂解液提蛋白 已有4人参与

我用裂解液提蛋白,离心后,说是取上清液,可是我离心后,不分层也没有沉淀,我想问一下是什么原因啊
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-06-30 15:21:20
你的意思是说PBS漂洗过之后直接加上样缓冲液,然后用细胞刮刮下来?我做的膜蛋白,WB效果一直不好,条带曝不出来,怀疑提取时候出现问题或者抗体的问题。...

楼主理解的没错,1X上样缓冲液中含有SDS可以使细胞蛋白变性,后续煮沸时,高温可使细胞破碎,使蛋白释放出来,这种方法没问题,我自己这样做过。如果怀疑蛋白提的不好,可以选择用专门的试剂盒或者专门的裂解液。另外楼主做膜蛋白要选择该蛋白表达丰度较高的细胞系进行实验,可以试试细胞量增多,裂解液体积减少,使蛋白浓度增大,可能会使目的蛋白浓度增大。不过一般蛋白提取问题不大,另外一抗的选择很重要,有的抗体是真心做不出来结果。祝好~~
9楼2015-06-30 20:37:15
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sageyaya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你提的是什么蛋白呢?细胞还是组织?多少量对应了多少裂解液呢?是不是加的太少了,没有完全裂解呢。
2楼2015-06-27 16:39:33
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
mtyx: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-06-27 21:22:09
楼主提的样品是什么,细胞还是组织,如果是细胞的话,放入裂解液后将细胞团吹散,冰上裂解30min,12000rpm,4度离心15min取上清即可,如果是组织的话要先将组织样本冰上磨碎,可以匀浆,也可以液氮研磨,之后加裂解液冰上裂解30min,之后的步骤是一样的。裂解液中记得加入蛋白酶抑制剂,冰上裂解中间可以混匀几次。祝好~~
3楼2015-06-27 17:59:43
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mtyx

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 504775490 at 2015-06-27 17:59:43
楼主提的样品是什么,细胞还是组织,如果是细胞的话,放入裂解液后将细胞团吹散,冰上裂解30min,12000rpm,4度离心15min取上清即可,如果是组织的话要先将组织样本冰上磨碎,可以匀浆,也可以液氮研磨,之后加裂解 ...

是细胞,12孔板,每孔加入100ul的裂解液
4楼2015-06-29 11:02:26
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