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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blot出现很多杂带，求助，交流？谢谢
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小_菜鸟

新虫 (小有名气)

[求助] western blot出现很多杂带，求助，交流？谢谢 已有2人参与

SDS-PAGE有三条带，western blot刚开始用5%脱脂奶粉封闭2h； 一抗HIS 1:1000，2h；二抗羊抗兔1:5000，2h；洗涤用TBST 5X5min，出现超多的杂带，降低一抗（1:3000）、二抗（1:10000）的浓度后从一束的杂带到只剩三条杂带，而且大小偏大，目的蛋白加上his应该在20KDa左右，但现在出现的三条都是偏大的，有没有战友做过啊？改怎么去调整比较好呢？谢谢啦（表达载体是pET28a+）

western blot出现很多杂带，求助，交流？谢谢
SDS-PAGE.jpg


western blot出现很多杂带，求助，交流？谢谢-1
很多杂带.jpg


western blot出现很多杂带，求助，交流？谢谢-2
连对照都出现了.jpg


western blot出现很多杂带，求助，交流？谢谢-3
这是调整抗体浓度后的.jpg
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1楼 2015-06-17 22:41:19
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小_菜鸟(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:44:39
我个人认为可能是：
一。SDS PAGE电泳出的问题：
1.SDS电泳时，样品上样前处理不好，可能SDS的量不够，平均1克蛋白质结合1.4克SDS，实际操作时SDS还应该多一些。
2.电泳时间可能没有掌握好。
3.可能是SDS电泳的“鬼带”“出现了。
鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时， 常会出现在泳道顶端 （有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀， 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。

有关SDS电泳的各种异常情况可以参考：
SDS-PAGE 电泳问题讨论（实例版）-----凌波丽个人总结之四
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7324819

二、抗体-抗原相互作用出的问题：
另外，就是楼主的抗体的原因了。
很可能一抗的专一性不够，或者用量还是大了。
或者二抗的专一性不够。
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小_菜鸟
3楼2015-06-19 11:32:42
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樱落feng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小_菜鸟(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:44:26
个人觉得你的二抗孵育时间有点长，TBST的洗涤时间应该长一点，10min左右，次数4-5次，可以考虑下4度封闭过夜，从图片上看杂带较多。
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努力活着，努力微笑
2楼2015-06-19 11:07:32
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小_菜鸟

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 11:32:42
我个人认为可能是：
一。SDS PAGE电泳出的问题：
1.SDS电泳时，样品上样前处理不好，可能SDS的量不够，平均1克蛋白质结合1.4克SDS，实际操作时SDS还应该多一些。
2.电泳时间可能没有掌握好。
3.可能是SDS电泳的 ...

谢谢你，我再试试您的方法，到时再看看结婚有没有更好。

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2015-06-19 15:01:20
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小_菜鸟

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 樱落feng at 2015-06-19 11:07:32
个人觉得你的二抗孵育时间有点长，TBST的洗涤时间应该长一点，10min左右，次数4-5次，可以考虑下4度封闭过夜，从图片上看杂带较多。

最后一，洗得比较久，封闭过夜也做过，结果还是不太好。我再试试，谢谢你。
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5楼2015-06-19 16:05:01
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