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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做western blotting时，抗体稀释倍数对结果影响大吗？
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bb123456789

金虫 (正式写手)

[交流] 做western blotting时，抗体稀释倍数对结果影响大吗？

这段时间在做western blotting，样品是各个组织的总蛋白。前两次做一抗分别按1:6000和1:8000稀释的，后两次做用的1:10000.前两次做有结果，只是背景复杂，后两次没结果也看不到任何杂带。请大家帮忙分析分析吧。

第一个泳道是蛋白质marker，最后一个是纯化蛋白，中间是各组织样品。
做western blotting时，抗体稀释倍数对结果影响大吗？
20131104_213436.jpg


做western blotting时，抗体稀释倍数对结果影响大吗？-1
20131104_213336.jpg
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1楼 2013-11-04 21:41:09
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bingdong05

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 11:56:47
bb123456789: 金币+1, 是一抗孵育后多洗几次还是一抗二抗孵育后均多洗几次呢 2013-11-06 09:21:33
影响很大的，稀释倍数过低，背景很重，倍数过高的话一般条带较清晰，以前做的时候我都是按照1：10000稀释（说明书貌似建议6000，具体不记得了哈），楼主可以试着稀释8000左右，多洗涤几次，多洗涤几次，若是背景还是很杂，再放大稀释倍数
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2楼2013-11-05 09:26:45
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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by bingdong05 at 2013-11-05 09:26:45
影响很大的，稀释倍数过低，背景很重，倍数过高的话一般条带较清晰，以前做的时候我都是按照1：10000稀释（说明书貌似建议6000，具体不记得了哈），楼主可以试着稀释8000左右，多洗涤几次，多洗涤几次，若是背景还是 ...

请问一下，背景很重是什么意思？
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3楼2013-11-05 09:29:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 11:56:53
bb123456789: 金币+1, 非常感谢 2013-11-06 09:22:35
可能你的目标蛋白的丰度不是很高，所以组织样品没有信号。但能测到纯化蛋白的信号，说明抗体工作，最好增加样品上样量并稀释纯化蛋白。一抗的稀释倍数当然比较重要，你的情况应该适当减少稀释倍数。
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4楼2013-11-05 09:31:29
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bingdong05

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
bb123456789: 金币+1 2013-11-06 09:34:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by w雨过天晴j at 2013-11-05 09:29:18
请问一下，背景很重是什么意思？...

杂带很多，另外，三楼兄弟的提议你也要注意哈
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5楼2013-11-05 09:33:21
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bb123456789

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by w雨过天晴j at 2013-11-05 09:29:18
请问一下，背景很重是什么意思？...

就像第一张片子，带型模糊有杂带
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6楼2013-11-06 09:34:56
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简牧风爱

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你要考虑抗体可检测的范围
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7楼2014-07-12 19:18:08
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