| 查看: 2675 | 回复: 5 | ||
[求助]
western blot出现很多杂带，求助，交流？谢谢 已有2人参与
|
SDS-PAGE有三条带，western blot刚开始用5%脱脂奶粉封闭2h； 一抗HIS 1:1000，2h；二抗羊抗兔1:5000，2h；洗涤用TBST 5X5min，出现超多的杂带，降低一抗（1:3000）、二抗（1:10000）的浓度后从一束的杂带到只剩三条杂带，而且大小偏大，目的蛋白加上his应该在20KDa左右，但现在出现的三条都是偏大的，有没有战友做过啊？改怎么去调整比较好呢？谢谢啦（表达载体是pET28a+） SDS-PAGE.jpg  很多杂带.jpg  连对照都出现了.jpg  这是调整抗体浓度后的.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有256人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 文章中的western blot图为和都没有marker?
已经有3人回复
- 求助western blot非特异条带非常多
已经有6人回复
- 求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法
已经有7人回复
- western blot出现多条带是什么原因
已经有8人回复
- western blot的阴性对照怎么设计啊？
已经有4人回复
- Western 内参抗体GAPDH
已经有12人回复
- 做western blotting时，抗体稀释倍数对结果影响大吗？
已经有6人回复
- western blot中古怪的非特异性条带
已经有9人回复
- western 中，目的蛋白没有，但是Marker 暴出来了，什么原因啊
已经有16人回复
- western-blot实验结果，大家帮忙分析下
已经有7人回复
- 如何在蛋白纯化后去除6组氨酸(6His)标签
已经有17人回复
- 求助，Western-Blot转膜不成功
已经有22人回复
- 为啥western有这么多条带
已经有18人回复
- 【求助/交流】westernblot
已经有10人回复
- 【求助/交流】western blot的内参总是不齐怎么办
已经有19人回复
- 【求助/交流】PCR产物切胶回收，总是有一条杂带的大小是目的片段的两倍大小
已经有8人回复
- 【求助/交流】请教大分子量蛋白western blot转膜的一些问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】western-blot 一抗孵育时间是不是越长越好
已经有7人回复
- 【求助/交流】westernblot的背景怎么消除呀
已经有10人回复
- 【求助/交流】请教Western blot出现非特异性条带的怎么解决
已经有8人回复
- 【求助/交流】western blot中，蛋白经SDSPAGE后不是变性了吗，怎么还能和一抗结合？
已经有13人回复
- 【求助/交流】western blot 的一抗二抗由来？
已经有4人回复
- 【求助/交流】western blot用奶粉封闭的原理
已经有18人回复
樱落feng
金虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 892.6
- 帖子: 91
- 在线: 22.8小时
- 虫号: 2409548
- 注册: 2013-04-09
- 性别: MM
- 专业: 免疫识别/免疫耐受/免疫调
2楼2015-06-19 11:07:32
calorimetry
铜虫 (正式写手)
- 应助: 51 (初中生)
- 金币: 126.8
- 红花: 13
- 帖子: 569
- 在线: 36.5小时
- 虫号: 3901654
- 注册: 2015-06-01
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小_菜鸟(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:44:39
感谢参与，应助指数 +1
小_菜鸟(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:44:39
|
我个人认为可能是： 一。SDS PAGE电泳出的问题： 1.SDS电泳时，样品上样前处理不好，可能SDS的量不够，平均1克蛋白质结合1.4克SDS，实际操作时SDS还应该多一些。 2.电泳时间可能没有掌握好。 3.可能是SDS电泳的“鬼带”“出现了。 鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时， 常会出现在泳道顶端 （有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀， 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。 有关SDS电泳的各种异常情况可以参考： SDS-PAGE 电泳问题讨论（实例版）-----凌波丽个人总结之四 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7324819 二、抗体-抗原相互作用出的问题： 另外，就是楼主的抗体的原因了。 很可能一抗的专一性不够，或者用量还是大了。 或者二抗的专一性不够。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
小_菜鸟3楼2015-06-19 11:32:42
4楼2015-06-19 15:01:20
5楼2015-06-19 16:05:01
calorimetry
铜虫 (正式写手)
- 应助: 51 (初中生)
- 金币: 126.8
- 红花: 13
- 帖子: 569
- 在线: 36.5小时
- 虫号: 3901654
- 注册: 2015-06-01
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
6楼2015-06-23 08:33:17
20