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michacel1217银虫 (小有名气)
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[求助]
蛋白纯化-离子交换咨询 已有1人参与
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现在在做一个蛋白的纯化与分离，进过酶切之后，需要将酶与切下的片段去除，这两个蛋白的PI在5.0左右，而我的目的蛋白PI在7.0左右。 现打算将蛋白溶液PH调制6.0，先使用阴离子交换剂挂杂蛋白，收集目的蛋白，再调PH至5.0，使用阳离子交换剂浓缩我的目的蛋白，打算使用PB缓冲液，不知该方法是否可行，敬请指点！ |
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7楼2015-07-07 21:53:10
calorimetry
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【答案】应助回帖
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对于大多数的分离纯化蛋白质步骤，建议刚开始就是用强离子交换柱，可以在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择离子交换剂（离子交换剂是连接在介质上的功能基团，也可以指离子交换介质本身）。如果用阴离子交换剂，使用缓冲溶液的pH值应该高于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质该缓冲溶液中带有净负电荷，可以与交换层析柱上的阴离子交换剂发生静电结合。如果选用阳离子交换剂，缓冲溶液的pH应低于蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲溶液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。 在考虑离子交换剂（离子交换功能基团）的强弱时，如果目的蛋白质很稳定，应首先选用强交换介质，强交换介质的动力载量不会随pH值的不同而改变，离子交换过程遵循最基本的吸附原理。所谓的蛋白质的稳定性，一般可从其耐受的酸碱性、离子强度、温度范围这几个角度考虑，考虑蛋白质的稳定的极限是防止蛋白质变性，而不是发生蛋白质共价修饰，甚至降解。用各种层析柱分离提纯蛋白质时，一般不是常温，就是低温，所以通常不必考虑温度对于需要层析的目的蛋白质的影响，但是蛋白质的酸碱性和离子强度的耐受性则必须要考虑。这点是很多蛋白质分离提纯的新手所容易忽略的。 使用强离子交换介质允许较大的吸附pH及离子交换强度选择范围，目的分子吸附后只需要提高缓冲的盐浓度即可洗脱，同时可有目的分子的浓缩效应。而若离子交换介质pH适用范围较小，在pH小于6时，弱阳离子交换介质失去点和，而在pH大于9时，弱阴离子交换介质失去电荷。所以，一般情况下，在分离等电点pH 6-9的目的蛋白质，尤其是当目的蛋白质分子不稳定时，需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。对于未知的蛋白质进行离子交换层析柱分离提纯时，也建议首先使用弱交换介质。 结合楼主的具体情况，阳离子用PB溶液当然可以醋酸盐、柠檬酸、甘氨酸等也可以。阴离子交换层析不能用PB缓冲溶液，要用Tris、乙二胺、咪唑等。其实缓冲溶液的浓度异地要低，甚至可以低于10mmol/L，洗脱时尽量用梯度洗脱。两个蛋白的pI在5.0左右，现打算将蛋白溶液pH调制6.0，这时杂蛋白质带有净负电荷，而你的目的蛋白质带有净正电荷，此时使用阴离子交换剂当然会挂上负电荷的杂蛋白，能够收集目的蛋白。而后把蛋白质缓冲溶液再调PH至5.0，可以直接用PB作为缓冲溶液，此时目的蛋白质带有净正电荷，那么可用阳离子交换柱分离出目的蛋白质，洗脱时可以恒定PB的浓度，但是加大NaCl溶液的浓度。 |
2楼2015-06-11 17:15:14
calorimetry
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【答案】应助回帖
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第二段更正（原文有些错别字）： 结合楼主的具体情况，阳离子用PB溶液当然可以，也可用醋酸盐、柠檬酸、甘氨酸等也可以。阴离子交换层析不能用PB缓冲溶液，要用Tris、烷基胺、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等。起始缓冲溶液的浓度应该尽量低要低，甚至可以低于10mmol/L，洗脱时尽量用梯度洗脱。两个蛋白的pI在5.0左右，现打算将蛋白溶液pH调制6.0，这时杂蛋白质带有净负电荷，而你的目的蛋白质带有净正电荷，此时使用阴离子交换剂当然会挂上负电荷的杂蛋白，能够收集目的蛋白。而后把蛋白质缓冲溶液再调PH至5.0，可以直接用PB作为缓冲溶液，此时目的蛋白质带有净正电荷，那么可用阳离子交换柱分离出目的蛋白质，洗脱时可以恒定PB的浓度，但是加大NaCl溶液的浓度。 |
3楼2015-06-11 17:19:59
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4楼2015-06-11 17:22:47
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