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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pET原核表达系统的几个疑问
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laqiwe

铁虫 (正式写手)

[求助] pET原核表达系统的几个疑问 已有3人参与

如图是pET-30a的克隆表达区域
1.原核表达都必需RBS序列，那么RBS序列前的XbaI这个酶切位点有什么用？
2.假设用EcoRI和BamHI两个酶切位点插入，那么NdeI后的His-Tag和S-Tag被表达后如何除去？
3.假设还是用EcoRI和BamHI两个酶切位点插入目的基因，如果目的基因两端的酶切位点顺序与载体的相反怎么办？

pET原核表达系统的几个疑问
图像 1.png
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1楼 2015-03-07 21:25:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
laqiwe(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-08 19:41:57
laqiwe: 金币+45, ★★★很有帮助 2015-03-09 08:39:36
1,告诉你如果用XbaI，就会把RBS切掉。
2，如果想一个氨基酸都不多，那就5‘端用NcoI，这样用enterokinase切，可以切得最干净，别的无论什么位点克隆都有可能多出几个氨基酸。
3，如果反了，重新设计含正确酶切位点的引物，PCR扩增后再切，就可以连了。
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3楼2015-03-08 08:49:54
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普通回帖

liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
laqiwe(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-08 19:41:49
laqiwe: 金币+45, ★★★很有帮助 2015-03-09 08:39:17
1.原始载体是没有RBS的，构建载体的人获得RBS序列后通过酶切连接的方式将它接到原始载体上，至于为什么选这个酶切位点就看构建者的习惯了。这个位置有酶切位点也比较方便载体的进一步改造。
2.你可以在你自己的基因后面接上蛋白酶切位点，比如“基因-蛋白酶切位点-his或s标签”形式，蛋白表达出来后用蛋白酶切掉标签。
3.这个问题我有些不太明白！酶切位点都是回文序列，正向和反向读都是一样的，你把它颠倒过来后它还是原来那个样所以我不清楚你说的颠倒是怎么回事。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-03-07 23:27:44
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangyue115 at 2015-03-08 08:49:54
1,告诉你如果用XbaI，就会把RBS切掉。
2，如果想一个氨基酸都不多，那就5‘端用NcoI，这样用enterokinase切，可以切得最干净，别的无论什么位点克隆都有可能多出几个氨基酸。
3，如果反了，重新设计含正确酶切位点 ...

关于2，有时候NcoI也会多出一个或两个氨基酸，那就在5’端设计长引物，把EK酶的位点带着克隆，这是最准确的。
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4楼2015-03-08 08:53:00
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laqiwe

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangyue115 at 2015-03-08 08:53:00
关于2，有时候NcoI也会多出一个或两个氨基酸，那就在5’端设计长引物，把EK酶的位点带着克隆，这是最准确的。...

对于多克隆位点前没有ATG的载体目的基因5‘端是一定要有ATG的吗？
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5楼2015-03-08 12:09:41
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by laqiwe at 2015-03-08 12:09:41
对于多克隆位点前没有ATG的载体目的基因5‘端是一定要有ATG的吗？...

对于原核表达载体来说，不仅必须要有，还要有正确的位置。真核载体的ATG位置要求不是太高。
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6楼2015-03-09 01:48:49
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.RBs是指mRNA上的核糖体结合位点--mRNA 上必须有RBs，连接也不一定要表达呀，可以为以后的克隆留条路。
2.第二个问题楼主可以用NDEI和XHOLI的酶切位点，直接把前面的标签全切了，后面的加终止密码子或氨基酸错位都可以。
3.只要把酶切位点BamHI放在上游引物前，把EcoRI放在下游引物前，100%不会出现酶切位点顺序与载体的相反这种情况。
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采菊东篱下，悠然见南山。
7楼2015-03-09 12:12:54
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by laqiwe at 2015-03-08 12:09:41
对于多克隆位点前没有ATG的载体目的基因5‘端是一定要有ATG的吗？...

pET30a的RBS，AAGGAG和ATG之间的最适距离8个氨基酸。RBS上结合核糖体后才能使ATG得启动密码子开始工作。两个都很重要。
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采菊东篱下，悠然见南山。
8楼2015-03-09 12:17:32
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuderong at 2015-03-07 23:27:44
1.原始载体是没有RBS的，构建载体的人获得RBS序列后通过酶切连接的方式将它接到原始载体上，至于为什么选这个酶切位点就看构建者的习惯了。这个位置有酶切位点也比较方便载体的进一步改造。
2.你可以在你自己的基因 ...

您好，his纯化标签和his-tag 序列是不是不一样呀
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9楼2015-08-21 10:28:40
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xuanrufeng

金虫 (小有名气)
话说你选择EcoRI和BamHI作为酶切位点，能切开么  求解答？？？
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本性难移
10楼2016-03-02 21:54:37
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