应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pET原核表达系统的几个疑问
51/1返回列表
查看: 2452  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

laqiwe

铁虫 (正式写手)

[求助] pET原核表达系统的几个疑问 已有3人参与

如图是pET-30a的克隆表达区域
1.原核表达都必需RBS序列，那么RBS序列前的XbaI这个酶切位点有什么用？
2.假设用EcoRI和BamHI两个酶切位点插入，那么NdeI后的His-Tag和S-Tag被表达后如何除去？
3.假设还是用EcoRI和BamHI两个酶切位点插入目的基因，如果目的基因两端的酶切位点顺序与载体的相反怎么办？

pET原核表达系统的几个疑问
图像 1.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-03-07 21:25:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.RBs是指mRNA上的核糖体结合位点--mRNA 上必须有RBs，连接也不一定要表达呀，可以为以后的克隆留条路。
2.第二个问题楼主可以用NDEI和XHOLI的酶切位点，直接把前面的标签全切了，后面的加终止密码子或氨基酸错位都可以。
3.只要把酶切位点BamHI放在上游引物前，把EcoRI放在下游引物前，100%不会出现酶切位点顺序与载体的相反这种情况。
赞一下 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
7楼2015-03-09 12:12:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laqiwe(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-08 19:41:49
laqiwe: 金币+45, ★★★很有帮助 2015-03-09 08:39:17
1.原始载体是没有RBS的，构建载体的人获得RBS序列后通过酶切连接的方式将它接到原始载体上，至于为什么选这个酶切位点就看构建者的习惯了。这个位置有酶切位点也比较方便载体的进一步改造。
2.你可以在你自己的基因后面接上蛋白酶切位点，比如“基因-蛋白酶切位点-his或s标签”形式，蛋白表达出来后用蛋白酶切掉标签。
3.这个问题我有些不太明白！酶切位点都是回文序列，正向和反向读都是一样的，你把它颠倒过来后它还是原来那个样所以我不清楚你说的颠倒是怎么回事。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
2楼2015-03-07 23:27:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laqiwe(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-08 19:41:57
laqiwe: 金币+45, ★★★很有帮助 2015-03-09 08:39:36
1,告诉你如果用XbaI，就会把RBS切掉。
2，如果想一个氨基酸都不多，那就5‘端用NcoI，这样用enterokinase切，可以切得最干净，别的无论什么位点克隆都有可能多出几个氨基酸。
3，如果反了，重新设计含正确酶切位点的引物，PCR扩增后再切，就可以连了。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2015-03-08 08:49:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangyue115 at 2015-03-08 08:49:54
1,告诉你如果用XbaI，就会把RBS切掉。
2，如果想一个氨基酸都不多，那就5‘端用NcoI，这样用enterokinase切，可以切得最干净，别的无论什么位点克隆都有可能多出几个氨基酸。
3，如果反了，重新设计含正确酶切位点 ...

关于2，有时候NcoI也会多出一个或两个氨基酸，那就在5’端设计长引物，把EK酶的位点带着克隆，这是最准确的。
赞一下 回复此楼
4楼2015-03-08 08:53:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭