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laqiwe铁虫 (正式写手)
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pET原核表达系统的几个疑问 已有3人参与
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如图是pET-30a的克隆表达区域 1.原核表达都必需RBS序列，那么RBS序列前的XbaI这个酶切位点有什么用？ 2.假设用EcoRI和BamHI两个酶切位点插入，那么NdeI后的His-Tag和S-Tag被表达后如何除去？ 3.假设还是用EcoRI和BamHI两个酶切位点插入目的基因，如果目的基因两端的酶切位点顺序与载体的相反怎么办？  图像 1.png |
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wangyue115
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1,告诉你如果用XbaI，就会把RBS切掉。 2，如果想一个氨基酸都不多，那就5‘端用NcoI，这样用enterokinase切，可以切得最干净，别的无论什么位点克隆都有可能多出几个氨基酸。 3，如果反了，重新设计含正确酶切位点的引物，PCR扩增后再切，就可以连了。 |
3楼2015-03-08 08:49:54
liuderong
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1.原始载体是没有RBS的，构建载体的人获得RBS序列后通过酶切连接的方式将它接到原始载体上，至于为什么选这个酶切位点就看构建者的习惯了。这个位置有酶切位点也比较方便载体的进一步改造。 2.你可以在你自己的基因后面接上蛋白酶切位点，比如“基因-蛋白酶切位点-his或s标签”形式，蛋白表达出来后用蛋白酶切掉标签。 3.这个问题我有些不太明白！酶切位点都是回文序列，正向和反向读都是一样的，你把它颠倒过来后它还是原来那个样所以我不清楚你说的颠倒是怎么回事。 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
2楼2015-03-07 23:27:44
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