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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 碱基序列一样，在大肠杆菌里表达的蛋白大小不一样是怎么回事？
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zhaiaguan

金虫 (初入文坛)

[求助] 碱基序列一样，在大肠杆菌里表达的蛋白大小不一样是怎么回事？ 已有4人参与

从模板细菌基因组里PCR出的基因片段，连接到pet32a载体上，在BL21(DE3)表达，质粒测序一模一样，表达出的蛋白一个和预期大小一致，另外一个却比预期的大了近一倍，是怎么回事？谢谢！
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1楼 2015-03-04 11:13:10
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zhang001zh

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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zhaiaguan: 金币+1 2015-03-06 09:39:13
跑的是还原电泳么？  是不是二聚体

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-03-04 15:21:58
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zhaiaguan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang001zh at 2015-03-04 15:21:58
跑的是还原电泳么？  是不是二聚体

什么是还原电泳？我跑的SDS-PAGE
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3楼2015-03-04 15:44:10
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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zhaiaguan: 金币+1 2015-03-06 09:39:00
稀有密码子也有可能，发图来看看。。。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-03-04 16:20:26
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绿宇基因

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaiaguan: 金币+1 2015-03-06 09:39:21
查查装载体时是不是形成了串联重复， 测序时是不是一次性测通的？
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5楼2015-03-04 17:11:09
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独行的小凉

金虫 (小有名气)
★
zhaiaguan(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-07 23:03:40
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaiaguan at 2015-03-04 15:44:10
什么是还原电泳？我跑的SDS-PAGE...

SDS-PAGE有还原非还原之分，区别在于buffer里是不是加了巯基乙醇或是二硫苏糖醇，作用打开分子内或是分子间的二硫键。如果是非还原电泳，有可能是因为分子间二硫键错配等原因形成了二聚体，楼主不妨试试还原电泳~
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逐鹿者不顾兔
6楼2015-03-06 11:02:16
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

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zhaiaguan(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-07 23:03:59
zhaiaguan: 金币+1 2015-03-09 09:34:14
在SDS上，如果是同样一个蛋白跑胶，不会出现太大的不同，你这种情况肯定是上一步已经出现问题的，表达的蛋白已经不是一个蛋白了，所以出现两个不同大小的带
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-03-06 13:23:44
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zhaiaguan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 独行的小凉 at 2015-03-06 11:02:16
SDS-PAGE有还原非还原之分，区别在于buffer里是不是加了巯基乙醇或是二硫苏糖醇，作用打开分子内或是分子间的二硫键。如果是非还原电泳，有可能是因为分子间二硫键错配等原因形成了二聚体，楼主不妨试试还原电泳~...

样品里我加了有β-巯基乙醇的
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8楼2015-03-09 10:06:04
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独行的小凉

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaiaguan at 2015-03-09 10:06:04
样品里我加了有β-巯基乙醇的...

楼主确定上游构建没问题只是电泳表现不合适，你可以试试还原性更强的二硫苏糖醇，我有遇到过巯基乙醇不能完全破坏二硫键的情况。不过这得根据你蛋白的具体情况具体分析，电泳行为异常可能跟蛋白性质有关，也可能跟构建有关的
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逐鹿者不顾兔
9楼2015-04-11 10:50:07
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