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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液测序结果是空载体序列
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白纸团子

新虫 (小有名气)

[交流] 菌液测序结果是空载体序列 已有2人参与

做了蓝白斑筛选，菌液验证PCR也能扩出目的条带500bp左右 ，测序是用通用的引物，几批测序结果都是空载体序列，求解释问题出在哪里了

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1楼 2015-02-01 16:50:59
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-02 21:10:37
没连上，重新连，建议菌液PCR检测时用通用引物。
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2楼2015-02-02 12:24:02
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白纸团子

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-02-02 12:24:02
没连上，重新连，建议菌液PCR检测时用通用引物。

好的，谢谢

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3楼2015-02-02 14:25:47
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许三多

木虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-03 22:13:53
菌液检测时，分别用通用引物和特异引物，对应的菌液均有条带，且通用引物比特异引物长（空载通用引物间长度），才必要送测序。摇菌时，也要注意摇菌时间和温度，以免质粒降解
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4楼2015-02-03 10:21:40
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白纸团子

新虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 许三多 at 2015-02-03 10:21:40
菌液检测时，分别用通用引物和特异引物，对应的菌液均有条带，且通用引物比特异引物长（空载通用引物间长度），才必要送测序。摇菌时，也要注意摇菌时间和温度，以免质粒降解

用的T载体按说明书16度一小时连接的。感受态是买的DH5a,应该没有问题。做了蓝白斑筛选，菌落长的也很好。验证时只用了特异性引物，目的条带特别亮，，质粒抽提后的电泳条带，只有胶空附近的一条(正常不是三条么)？求指导，，，以前这样都能测序成功，怎么这几次都不行了

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5楼2015-02-03 22:05:01
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许三多

木虫 (著名写手)
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5楼: Originally posted by 白纸团子 at 2015-02-03 22:05:01
用的T载体按说明书16度一小时连接的。感受态是买的DH5a,应该没有问题。做了蓝白斑筛选，菌落长的也很好。验证时只用了特异性引物，目的条带特别亮，，质粒抽提后的电泳条带，只有胶空附近的一条(正常不是三条么)？ ...

你的载体通用引物间长度是多少，你比较下看。质粒只有一条带，很可能是降解了。可能是摇菌摇的不好，或者质粒试剂盒的问题。T载体连接可以试试延长时间，我们是TAKARA 的pMD19-T，过夜连接。测序结果是空载，应该就是没连上
分子生物学实验非常敏感，实验室一定要仔细，每一步都要小心。
再有，做实验的时候，该有的对照不要省
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6楼2015-02-04 12:40:35
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白纸团子

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by 许三多 at 2015-02-04 12:40:35
你的载体通用引物间长度是多少，你比较下看。质粒只有一条带，很可能是降解了。可能是摇菌摇的不好，或者质粒试剂盒的问题。T载体连接可以试试延长时间，我们是TAKARA 的pMD19-T，过夜连接。测序结果是空载，应该就 ...

我们用的也是TAKARA的PMD19~T，过夜连接是16度过夜么？还是4度过夜？摇菌温度37度，200rpm

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7楼2015-02-04 13:58:43
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许三多

木虫 (著名写手)
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7楼: Originally posted by 白纸团子 at 2015-02-04 13:58:43
我们用的也是TAKARA的PMD19~T，过夜连接是16度过夜么？还是4度过夜？摇菌温度37度，200rpm
...

16度过夜，至少8小时。那你现在可以考虑考虑感受态了，用新开封的，或者自己制一批。我们都是自己制的，超过2个月的不用，2个月间冰箱开门次数过多的不用。总是小心小心再小心
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8楼2015-02-04 16:15:44
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白纸团子

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 许三多 at 2015-02-04 16:15:44
16度过夜，至少8小时。那你现在可以考虑考虑感受态了，用新开封的，或者自己制一批。我们都是自己制的，超过2个月的不用，2个月间冰箱开门次数过多的不用。总是小心小心再小心...

好的谢谢

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9楼2015-02-04 17:27:00
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