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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR遇到难题-求指点
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fx1120130150

新虫 (初入文坛)

[交流] 荧光定量PCR遇到难题-求指点 已有5人参与

最近正在做荧光定量PCR，制作标准曲线时遇到一个问题，试验中，我把我的目的基因与载体连接后导入到感受态大肠菌中，然后液体培养提质粒，质粒DNA为模板进行定性PCR检测目的基因，检测结果为阳性，到这一步也没有问题，可是我把质粒梯度稀释进行上机跑标准曲线时，结果Ct值都在30以后才出来，怕稀释出问题，重新稀释，也降低退火温度都又各做了一次还是同样的效果，头都大了~跪求高手指点！
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1楼 2015-01-28 17:43:23
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logowang

铜虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:08:34
建议：
1， 重新跑你的定性pcr, 并且使用高低两个循环数（25，30），并且做该pcr时，将plasmid浓度控制在10-20ng左右，这样的情况下，重新看你的条带是否良好。

2，如果都良好，那么很难解释你qpcr的结果，因为普通pcr都能看到条带，为啥qpcr无法检测，除非扩增长度存在问题，比如过短或者过长。应控制产物在200-500bp内。

3，以上都没有问题的话，只有提高你的plasmid浓度去做了，因为你的体系是没有问题的。虽然这样结果挺奇怪的。
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6楼2015-01-28 21:24:43
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logowang

铜虫 (小有名气)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:08:19
都是30 以上出现那么就是太稀了啊，要不就是非特异扩增啊，稀释倍数放低，重新再测试看看。
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2楼2015-01-28 18:58:19
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fx1120130150

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by logowang at 2015-01-28 18:58:19
都是30 以上出现那么就是太稀了啊，要不就是非特异扩增啊，稀释倍数放低，重新再测试看看。

非常感谢logowang的指点~~~我定性PCR时条带非常单一，而且还没有引物二聚体，可以排除非特异性扩增。Ct值都超过30太大，可能就是模板浓度太低了。但是我稀释10倍（这个倍数应该不是太大），对应的Ct值都31.79了。太不正常了~
做标准曲线一般都是十倍梯度稀释，至少5个点~我这？哎
2、4、6、8、10倍，这样可行吗？
期待继续指导~再次感谢~
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3楼2015-01-28 20:24:43
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logowang

铜虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:08:27
再多提点你要的plasmid吧。现在的情况下肯定是原液浓度都不够，那么怎么稀释都不会有太多的改善，尤其是你做标准曲线，最好数值分布好一些，这样就要你最低的ct能在22-25左右，甚至更低，这样的情况下，再看看你的plasmid浓度，就很难达到要求了。
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4楼2015-01-28 20:47:53
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fx1120130150

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by logowang at 2015-01-28 20:47:53
再多提点你要的plasmid吧。现在的情况下肯定是原液浓度都不够，那么怎么稀释都不会有太多的改善，尤其是你做标准曲线，最好数值分布好一些，这样就要你最低的ct能在22-25左右，甚至更低，这样的情况下，再看看你的p ...

做标准曲线的质粒原液浓度是146ng/微升，（同时做的另一个基因的标准质粒也是150ng/微升，这基因就做着正常，就是扩增效率低72、3%，R2=0.999.）；你建议我是培养克隆菌再多提些质粒，还是重新做一下克隆？
期待回复~真心谢谢~
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5楼2015-01-28 20:58:34
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fx1120130150

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by logowang at 2015-01-28 21:24:43
建议：
1， 重新跑你的定性pcr, 并且使用高低两个循环数（25，30），并且做该pcr时，将plasmid浓度控制在10-20ng左右，这样的情况下，重新看你的条带是否良好。

2，如果都良好，那么很难解释你qpcr的结果，因为 ...

好的，谢谢你logowang~明天我试一下，希望可以找到答案~
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7楼2015-01-28 22:25:18
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nara-jiang

铜虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by fx1120130150 at 2015-01-28 22:25:18
好的，谢谢你logowang~明天我试一下，希望可以找到答案~...

我也做荧光PCR，遇到过你这种情况。很可能是你质粒梯度没稀释好，重新稀释一次，注意防止污染。此外，还可以拿你已跑出的荧光PCR跑胶比较梯度稀释质粒扩增后各条带的亮度及宽度。
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8楼2015-01-29 11:24:21
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ivirus

金虫 (正式写手)
★
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我做的时候32才出来，和阴性对照相比较，仪器显示的也是阳性，也算是OK了。还有就是这个基准线是可以调节的，不知知道Lz用的那个牌子的机器哈

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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奔三的年纪 想换个环境
9楼2015-01-31 12:10:20
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★
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另外一个方法
使用质粒的测序引物，常见为M13序列，把你的质粒扩增一下，用纯化的产物来做模板，再去做一下梯度稀释和定量，，，这样也行的
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10楼2015-02-01 19:43:58
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