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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR遇到难题-求指点
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fx1120130150

新虫 (初入文坛)

[交流] 荧光定量PCR遇到难题-求指点已有5人参与

最近正在做荧光定量PCR，制作标准曲线时遇到一个问题，试验中，我把我的目的基因与载体连接后导入到感受态大肠菌中，然后液体培养提质粒，质粒DNA为模板进行定性PCR检测目的基因，检测结果为阳性，到这一步也没有问题，可是我把质粒梯度稀释进行上机跑标准曲线时，结果Ct值都在30以后才出来，怕稀释出问题，重新稀释，也降低退火温度都又各做了一次还是同样的效果，头都大了~跪求高手指点！
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1楼2015-01-28 17:43:23
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nara-jiang

铜虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by fx1120130150 at 2015-01-28 22:25:18
好的，谢谢你logowang~明天我试一下，希望可以找到答案~...

我也做荧光PCR，遇到过你这种情况。很可能是你质粒梯度没稀释好，重新稀释一次，注意防止污染。此外，还可以拿你已跑出的荧光PCR跑胶比较梯度稀释质粒扩增后各条带的亮度及宽度。
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8楼2015-01-29 11:24:21
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logowang

铜虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:08:19
都是30 以上出现那么就是太稀了啊，要不就是非特异扩增啊，稀释倍数放低，重新再测试看看。
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2楼2015-01-28 18:58:19
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fx1120130150

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by logowang at 2015-01-28 18:58:19
都是30 以上出现那么就是太稀了啊，要不就是非特异扩增啊，稀释倍数放低，重新再测试看看。

非常感谢logowang的指点~~~我定性PCR时条带非常单一，而且还没有引物二聚体，可以排除非特异性扩增。Ct值都超过30太大，可能就是模板浓度太低了。但是我稀释10倍（这个倍数应该不是太大），对应的Ct值都31.79了。太不正常了~
做标准曲线一般都是十倍梯度稀释，至少5个点~我这？哎
2、4、6、8、10倍，这样可行吗？
期待继续指导~再次感谢~
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3楼2015-01-28 20:24:43
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logowang

铜虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:08:27
再多提点你要的plasmid吧。现在的情况下肯定是原液浓度都不够，那么怎么稀释都不会有太多的改善，尤其是你做标准曲线，最好数值分布好一些，这样就要你最低的ct能在22-25左右，甚至更低，这样的情况下，再看看你的plasmid浓度，就很难达到要求了。
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4楼2015-01-28 20:47:53
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