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求助！！帮忙分析一下荧光定量的溶解曲线！！已有1人参与
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第一张是标准曲线和高表达量样品的溶解曲 第二张是低表达量样品的溶解曲线 也就是说二者的差别只在于模板量的多与少，可是这溶解曲线上的“鼓包”着实让人看着不爽啊~~大家帮忙分析一下，看是怎么解决！拜托！拜托！！  1.png  2.png |
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2楼2015-01-27 15:18:38
3楼2015-01-27 21:49:20
4楼2015-01-28 11:56:29
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xiaohaixie(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:11:43
xiaohaixie(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:11:43
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你的待测样品ct已经到32左右了。属于比较高的值了。不是很理想，这样的话，加上你的溶解曲线，真的会去怀疑你的低浓度扩增是否非特异。 因为以你的描述，引物使用是一致的，并且模板内容也是一样的，这样的话，高浓度下看起来引物并无太大问题，所以如果你是在做绝对定量，稀释的倍数不要太大，高浓度23cycle，低浓度32cycle这样差异太大了。调整低浓度在26cycle这样就能避免一些奇怪的事情 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
5楼2015-01-28 18:49:34
送红花一朵|
时间紧，所以之前就多合成了一对引物，昨天晚上稀释了一对新引物，序列与这对引物不同，问题解决了。所有待测样品都是细胞提RNA然后反转录后进行定量，不同的地方也就是细胞中该基因的表达量不同，在高表达mRNA和高浓度标准质粒中，产物单一，且无引物二聚体；低表达量中正如您所说问题就来了，关键还是条带不单一，之前跑琼脂糖胶也没分辨出来，引物浓度梯度也试了，降低了引物浓度，结果确实有很大改善，但是杂峰依然存在，说明有二聚体也有杂带。实验室前期有过一次气溶胶污染，摸条件时可是害苦了我，所以昨天一狠心，引物全换新的，到同学的实验室稀释、加样做定量，结果良好。 总结一下：关键是引物特异性不好，其次是有污染，因为前期用标准曲线样品进行PCR时发现高浓度标准样品中有杂带，越往低杂带就慢慢没了，所以平时严谨点不光是对自己负责，更是对别人负责，我的一个月时间就这样白白耗走了，再次感谢您的耐心回复！ |
6楼2015-01-29 16:08:28
7楼2015-01-29 17:42:48