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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助！！帮忙分析一下荧光定量的溶解曲线！！
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助！！帮忙分析一下荧光定量的溶解曲线！！ 已有1人参与

第一张是标准曲线和高表达量样品的溶解曲
第二张是低表达量样品的溶解曲线

也就是说二者的差别只在于模板量的多与少，可是这溶解曲线上的“鼓包”着实让人看着不爽啊~~大家帮忙分析一下，看是怎么解决！拜托！拜托！！

求助！！帮忙分析一下荧光定量的溶解曲线！！
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求助！！帮忙分析一下荧光定量的溶解曲线！！-1
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
1楼 2015-01-27 14:53:54
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
看见您之前回过的一个帖子，可以帮忙分析一下吗？@飞约疯人院
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
2楼2015-01-27 15:18:38
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logowang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiaohaixie(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:11:30
结合你的扩增曲线看一看，感觉上是你的低浓度模板浓度过低，没有得到特异扩增所需要的荧光强度，这样的话，溶解曲线多半都是引物二聚体峰，没什么参考价值。

如果你能得到良好的ct值（32以内），那么这样的溶解曲线没有办法去解释，你尝试更换体系（比如仪器或者板子），看看是否还有这样的杂峰。
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3楼2015-01-27 21:49:20
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by logowang at 2015-01-27 21:49:20
结合你的扩增曲线看一看，感觉上是你的低浓度模板浓度过低，没有得到特异扩增所需要的荧光强度，这样的话，溶解曲线多半都是引物二聚体峰，没什么参考价值。

如果你能得到良好的ct值（32以内），那么这样的溶解曲 ...

这是扩增曲线，第一张是标准曲线样品和高浓度待测样品的扩增曲线，第二张是低浓度待测样品的扩增曲线，ct值在30以内。。。不理解，引物二聚体在溶解曲线上的位置一般应该在哪？
求助！！帮忙分析一下荧光定量的溶解曲线！！-2
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求助！！帮忙分析一下荧光定量的溶解曲线！！-3
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
4楼2015-01-28 11:56:29
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logowang

铜虫 (小有名气)
★ ★
xiaohaixie(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:11:43
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaohaixie at 2015-01-28 11:56:29
这是扩增曲线，第一张是标准曲线样品和高浓度待测样品的扩增曲线，第二张是低浓度待测样品的扩增曲线，ct值在30以内。。。不理解，引物二聚体在溶解曲线上的位置一般应该在哪？

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...

你的待测样品ct已经到32左右了。属于比较高的值了。不是很理想，这样的话，加上你的溶解曲线，真的会去怀疑你的低浓度扩增是否非特异。 因为以你的描述，引物使用是一致的，并且模板内容也是一样的，这样的话，高浓度下看起来引物并无太大问题，所以如果你是在做绝对定量，稀释的倍数不要太大，高浓度23cycle，低浓度32cycle这样差异太大了。调整低浓度在26cycle这样就能避免一些奇怪的事情
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xiaohaixie
5楼2015-01-28 18:49:34
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by logowang at 2015-01-28 18:49:34
你的待测样品ct已经到32左右了。属于比较高的值了。不是很理想，这样的话，加上你的溶解曲线，真的会去怀疑你的低浓度扩增是否非特异。 因为以你的描述，引物使用是一致的，并且模板内容也是一样的，这样的话，高浓 ...

时间紧，所以之前就多合成了一对引物，昨天晚上稀释了一对新引物，序列与这对引物不同，问题解决了。所有待测样品都是细胞提RNA然后反转录后进行定量，不同的地方也就是细胞中该基因的表达量不同，在高表达mRNA和高浓度标准质粒中，产物单一，且无引物二聚体；低表达量中正如您所说问题就来了，关键还是条带不单一，之前跑琼脂糖胶也没分辨出来，引物浓度梯度也试了，降低了引物浓度，结果确实有很大改善，但是杂峰依然存在，说明有二聚体也有杂带。实验室前期有过一次气溶胶污染，摸条件时可是害苦了我，所以昨天一狠心，引物全换新的，到同学的实验室稀释、加样做定量，结果良好。
总结一下：关键是引物特异性不好，其次是有污染，因为前期用标准曲线样品进行PCR时发现高浓度标准样品中有杂带，越往低杂带就慢慢没了，所以平时严谨点不光是对自己负责，更是对别人负责，我的一个月时间就这样白白耗走了，再次感谢您的耐心回复！
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
6楼2015-01-29 16:08:28
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logowang

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaohaixie at 2015-01-29 16:08:28
时间紧，所以之前就多合成了一对引物，昨天晚上稀释了一对新引物，序列与这对引物不同，问题解决了。所有待测样品都是细胞提RNA然后反转录后进行定量，不同的地方也就是细胞中该基因的表达量不同，在高表达mRNA和高 ...

good luck
有不顺利的经验总结才能有顺利的结果产出
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7楼2015-01-29 17:42:48
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