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western blot 检测caspase-3遇到问题，求解答 已有2人参与
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本人通过DNA-ladder,已做出梯度条带，所以现在欲检测caspas-3，买的是abcam的caspase-3的多抗，说明书上说的是可以检测到caspase-3和cleaved caspase-3,但是现在的检测结果如图，实验组和对照组全部是一个情况。 western的大致过程如下 1）：用的是12%的胶；2）：半干转膜，15v，30min，；3）：5%脱脂乳封闭（37℃2h,3h,4℃过夜全部试过了）；4）：一抗按照说明书1:1000稀释，稀释液是PBS（实验室一直都是用PBS稀释，3%的BSA也试过了），时间事根据封闭时间选择4℃过夜或者37℃2h；5）：洗膜用TBST，10min/次，洗6次；6）：二抗同样用PBS稀释，1:5000（内参已经做出来了，应该不是二抗浓度的问题）；7）：洗膜同上；8）：显影，用ECL，根据说明书暗室3min。照相时的时间选择为5s,200s,50次（试过各种时间的设置，都不行）。 增加封闭时间，加大上样量都试过了，没有用。 求高手解答一下困惑，为什么会出现这种结果，该怎么办呀  1.jpg |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
| 我用的是santa cruz 的抗体，有35/20 Kd两条带，活化的caspase－3是20kd。一抗浓度是1：200，二抗浓度用的是1：1000（这个浓度比平时别的抗体浓度要高，一般我是用1：2000的），压片时间最长有30min的。我觉得cell signalling 的抗体是比较好的，至少我做过的抗体都不错。你说“同样分子量的其他蛋白都有条带”，这说明你的前面的步骤是没有问题的，我觉得可能是你的蛋白里面caspase－3的丰度比较的低，如果你的一抗的来源和二抗的匹配都没有问题的话，的你可以适当的把一抗孵育的时间，二抗的浓度，以及ECL曝光的时间延长一些，我做过的有的蛋白一抗孵育过夜还要ecl过夜才能出来条带呢。如果能有条带，哪怕不怎么好，你也可以再改条件。祝你好运！ |
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