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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 1700基因的克隆
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小六琦琦

新虫 (初入文坛)

[求助] 1700基因的克隆 已有3人参与

最近在克隆一个1700bp的基因，引物是根据转录组序列设计的。因为是全长， 所以引物没办法多选，只能是起始密码子开始，到终止密码子，但是无论怎么P，都P不出来~然后又做了一个3’RACE，得到了终止密码子后面的序列，根据3‘RACE的序列设计下游引物，依然P不出来~

但是单加一个全长正（反）引物，与一个中间位置的反（正）引物一起P，可以扩增上游1300bp，下游1200bp的片段，
曾经也拿Mix P出过一次1700的全长，但是因为是Mix，有错配，不能用~
以后拿LA Taq酶P，就再也消失不见了、、、、
但是能证明转录组序列是对的~

求各位大神指教，这是为什么呢？下一步该怎么做呢？
是引物的问题呢？还是模板有高级结构呢？
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1楼 2014-12-28 23:03:13
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-29 10:32:47
这一步不一定非要从其实密码子开始、终止密码子结束。只要保证你的产物包括起始密码子和终止密码子就行，这样引物可选择余地多些，扩出来连载体后，用阳性载体做模板，再用你起始密码子开始、终止密码子结束的引物扩就会容易很多。
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2楼2014-12-28 23:26:43
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-29 10:32:51
小六琦琦: 金币+2, ★有帮助 2014-12-29 19:29:45
我觉得你这种情况，可以这样，在上游1300和下游1200的重叠区试着找个酶切位点，通过这个酶切位点把两段分别连载体上，得到全长；或者用此两段同时做模版，全长的一对引物扩增，也许会比cDNA做模板效果好也不一定。

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3楼2014-12-29 06:29:26
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小六琦琦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-12-28 23:26:43
这一步不一定非要从其实密码子开始、终止密码子结束。只要保证你的产物包括起始密码子和终止密码子就行，这样引物可选择余地多些，扩出来连载体后，用阳性载体做模板，再用你起始密码子开始、终止密码子结束的引物扩 ...

因为只做了3‘RACE，5’端的序列不知道，所以只能在下游引物上下工夫，但是下游引物无论怎么改都会和上游的产生二聚体~
确定是引物的问题吗？有没有可能是模板有二级结构呢？
主要现在不知道从引物下手还是从模板下手，如果模板没有问题，就考虑多设计几个引物试一下。
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4楼2014-12-29 09:28:58
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小六琦琦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-12-29 06:29:26
我觉得你这种情况，可以这样，在上游1300和下游1200的重叠区试着找个酶切位点，通过这个酶切位点把两段分别连载体上，得到全长；或者用此两段同时做模版，全长的一对引物扩增，也许会比cDNA做模板效果好也不一定。
...

昨天刚拿了两段同时做模板，用全长的引物扩增，依然啥都没有~
在思考如果实在做不出来就直接连上，
但是还是想拿引物P出来呀~这样总感觉不舒服~
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5楼2014-12-29 09:31:06
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-29 10:32:55
小六琦琦: 金币+1, ★有帮助 2014-12-29 19:30:28
你这样试试，先在起始密码子和终止密码子处设计一对引物，引物序列稍微长一点，不加酶切位点，这样扩增效果可能会好一点，连到载体上之后再根据上面二楼仁兄的方法，挑选阳性克隆用加酶切位点的引物扩增，如果还是出不来，建议做个5'RACE在UTR区设计引物再做克隆。
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没有做不到，只有想不到！
6楼2014-12-29 10:31:30
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 小六琦琦 at 2014-12-29 09:31:06
昨天刚拿了两段同时做模板，用全长的引物扩增，依然啥都没有~
在思考如果实在做不出来就直接连上，
但是还是想拿引物P出来呀~这样总感觉不舒服~...

那就只能尝试分别连，我之前扩增一5K序列也是同样的分三次，是麻烦点儿，但顺利的话一周也出来了。只要测序正确就没啥不放心。如果有担心，可以将1300和1200的两扩增产物切胶回收测序，如果序列正确就一点问题也没有。祝你顺利！

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7楼2014-12-29 10:53:34
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小六琦琦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 王平阳 at 2014-12-29 10:31:30
你这样试试，先在起始密码子和终止密码子处设计一对引物，引物序列稍微长一点，不加酶切位点，这样扩增效果可能会好一点，连到载体上之后再根据上面二楼仁兄的方法，挑选阳性克隆用加酶切位点的引物扩增，如果还是出 ...

现在就是在起始密码子和终止密码子处设计的引物，还没加酶切位点，就扩不出来~
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8楼2014-12-29 15:20:02
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小六琦琦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-12-29 10:53:34
那就只能尝试分别连，我之前扩增一5K序列也是同样的分三次，是麻烦点儿，但顺利的话一周也出来了。只要测序正确就没啥不放心。如果有担心，可以将1300和1200的两扩增产物切胶回收测序，如果序列正确就一点问题也没 ...

好，我试试~今天就开始做~期待有好结果~谢谢！
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9楼2014-12-29 15:25:59
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南岸青栀55

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-12-29 10:53:34
那就只能尝试分别连，我之前扩增一5K序列也是同样的分三次，是麻烦点儿，但顺利的话一周也出来了。只要测序正确就没啥不放心。如果有担心，可以将1300和1200的两扩增产物切胶回收测序，如果序列正确就一点问题也没 ...

请问老师，之后是要做过表达的，这样分段p出来之后怎么能正好连接上呢

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10楼2019-09-17 16:03:07
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