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小六琦琦

新虫 (初入文坛)

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专业: 蛋白质组学

[求助] 1700基因的克隆已有3人参与

最近在克隆一个1700bp的基因，引物是根据转录组序列设计的。因为是全长，所以引物没办法多选，只能是起始密码子开始，到终止密码子，但是无论怎么P，都P不出来~然后又做了一个3’RACE，得到了终止密码子后面的序列，根据3‘RACE的序列设计下游引物，依然P不出来~

但是单加一个全长正（反）引物，与一个中间位置的反（正）引物一起P，可以扩增上游1300bp，下游1200bp的片段，
曾经也拿Mix P出过一次1700的全长，但是因为是Mix，有错配，不能用~
以后拿LA Taq酶P，就再也消失不见了、、、、
但是能证明转录组序列是对的~

求各位大神指教，这是为什么呢？下一步该怎么做呢？
是引物的问题呢？还是模板有高级结构呢？

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1楼 2014-12-28 23:03:13

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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-29 10:32:47

这一步不一定非要从其实密码子开始、终止密码子结束。只要保证你的产物包括起始密码子和终止密码子就行，这样引物可选择余地多些，扩出来连载体后，用阳性载体做模板，再用你起始密码子开始、终止密码子结束的引物扩就会容易很多。

2楼2014-12-28 23:26:43

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