应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 1700基因的克隆
51/1返回列表
查看: 1885  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

小六琦琦

新虫 (初入文坛)

[求助] 1700基因的克隆 已有3人参与

最近在克隆一个1700bp的基因，引物是根据转录组序列设计的。因为是全长， 所以引物没办法多选，只能是起始密码子开始，到终止密码子，但是无论怎么P，都P不出来~然后又做了一个3’RACE，得到了终止密码子后面的序列，根据3‘RACE的序列设计下游引物，依然P不出来~

但是单加一个全长正（反）引物，与一个中间位置的反（正）引物一起P，可以扩增上游1300bp，下游1200bp的片段，
曾经也拿Mix P出过一次1700的全长，但是因为是Mix，有错配，不能用~
以后拿LA Taq酶P，就再也消失不见了、、、、
但是能证明转录组序列是对的~

求各位大神指教，这是为什么呢？下一步该怎么做呢？
是引物的问题呢？还是模板有高级结构呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-12-28 23:03:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小六琦琦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 王平阳 at 2014-12-29 10:31:30
你这样试试，先在起始密码子和终止密码子处设计一对引物，引物序列稍微长一点，不加酶切位点，这样扩增效果可能会好一点，连到载体上之后再根据上面二楼仁兄的方法，挑选阳性克隆用加酶切位点的引物扩增，如果还是出 ...

现在就是在起始密码子和终止密码子处设计的引物，还没加酶切位点，就扩不出来~
赞一下 回复此楼
8楼2014-12-29 15:20:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-29 10:32:47
这一步不一定非要从其实密码子开始、终止密码子结束。只要保证你的产物包括起始密码子和终止密码子就行，这样引物可选择余地多些，扩出来连载体后，用阳性载体做模板，再用你起始密码子开始、终止密码子结束的引物扩就会容易很多。
赞一下 回复此楼
2楼2014-12-28 23:26:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-29 10:32:51
小六琦琦: 金币+2, ★有帮助 2014-12-29 19:29:45
我觉得你这种情况，可以这样，在上游1300和下游1200的重叠区试着找个酶切位点，通过这个酶切位点把两段分别连载体上，得到全长；或者用此两段同时做模版，全长的一对引物扩增，也许会比cDNA做模板效果好也不一定。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
3楼2014-12-29 06:29:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小六琦琦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-12-28 23:26:43
这一步不一定非要从其实密码子开始、终止密码子结束。只要保证你的产物包括起始密码子和终止密码子就行，这样引物可选择余地多些，扩出来连载体后，用阳性载体做模板，再用你起始密码子开始、终止密码子结束的引物扩 ...

因为只做了3‘RACE，5’端的序列不知道，所以只能在下游引物上下工夫，但是下游引物无论怎么改都会和上游的产生二聚体~
确定是引物的问题吗？有没有可能是模板有二级结构呢？
主要现在不知道从引物下手还是从模板下手，如果模板没有问题，就考虑多设计几个引物试一下。
赞一下 回复此楼
4楼2014-12-29 09:28:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭