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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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chenct002

金虫 (小有名气)

[求助] 丙酮沉淀蛋白后怎么溶解 已有5人参与

想请教各位,从细胞里面提取蛋白后,-20度丙酮沉淀蛋白,然后离心,请问离心的转速是不是不能太大?离心时间多久适宜?文献上是12000r,15min,我觉得这个是不是不行,离心太久后蛋白变成很硬的一团粘在EP管底部,怎么涡都涡不起来,超声2个小时也溶解不了?请问怎么解决?
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
chenct002: 金币+3, 有帮助 2014-12-08 09:44:01
1. 看你提的蛋白干什么用的,如果尿素硫脲对后续实验没影响的化,可以用7M尿素+2M硫脲溶解;
2. 去除丙酮风干时不宜过久,看不见明显液体即可。
科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
9楼2014-12-08 09:05:26
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lwpeng

金虫 (初入文坛)

★ ★
chenct002(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-10 20:08:37
引用回帖:
7楼: Originally posted by chenct002 at 2014-12-07 15:54:35
请问丙酮要是没有完全挥发干净,是不是会影响后续的再溶解,但又不能过度干燥?请问您这个怎么控制呢?...

丙酮沉淀之后要清洗,否则本身就让蛋白变性。这个度确实不好掌握,只有自己具体体会:可以仔细观察沉淀的蛋白边缘还是变透明,但中央较厚部分还没有完全干时,进行溶解。
10楼2014-12-10 18:45:43
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
chenct002: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-12-07 15:51:32
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-07 15:52:35
我做过从肝脏提取碱性磷酸酶,冷丙酮沉淀后,2000rpm离心5分钟,然后用tris缓冲液溶解的。
2楼2014-12-06 15:50:54
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-07 15:52:43
chenct002: 金币+2, 有帮助 2014-12-07 15:53:09
转速和时间最初参考相应参考文献,也要根据自己的实验目的和结果调整。溶解液必须用你后续实验的溶液。
慎思明辨博学笃行
3楼2014-12-06 17:06:26
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lwpeng

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
chenct002(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-07 15:52:53
chenct002: 金币+5 2014-12-07 15:53:34
丙酮沉淀后用酒精清洗晾干的时候,不能让蛋白过度干燥,否则溶解是很困难的。
4楼2014-12-06 22:36:32
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-07 15:53:01
chenct002: 金币+2, 有帮助 2014-12-07 15:54:49
SDS+超声
字数补丁
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
5楼2014-12-07 02:30:19
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普通回帖

chenct002

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-12-06 15:50:54
我做过从肝脏提取碱性磷酸酶,冷丙酮沉淀后,2000rpm离心5分钟,然后用tris缓冲液溶解的。

请问丙酮沉淀后,沉淀还需要用丙酮洗一遍吗?
6楼2014-12-07 15:52:55
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chenct002

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lwpeng at 2014-12-06 22:36:32
丙酮沉淀后用酒精清洗晾干的时候,不能让蛋白过度干燥,否则溶解是很困难的。

请问丙酮要是没有完全挥发干净,是不是会影响后续的再溶解,但又不能过度干燥?请问您这个怎么控制呢?
7楼2014-12-07 15:54:35
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chenct002

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2014-12-07 02:30:19
SDS+超声
字数补丁

这样也是不行,我试过,丙酮沉淀的时候需要加DTT吗?还是直接加丙酮沉淀就好了?
8楼2014-12-07 15:56:27
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