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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 丙酮沉淀蛋白后怎么溶解
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chenct002

金虫 (小有名气)

[求助] 丙酮沉淀蛋白后怎么溶解 已有5人参与

想请教各位，从细胞里面提取蛋白后，-20度丙酮沉淀蛋白，然后离心，请问离心的转速是不是不能太大？离心时间多久适宜？文献上是12000r，15min，我觉得这个是不是不行，离心太久后蛋白变成很硬的一团粘在EP管底部，怎么涡都涡不起来，超声2个小时也溶解不了？请问怎么解决？
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1楼 2014-12-06 14:14:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chenct002: 金币+3, ★有帮助 2014-12-08 09:44:01
1. 看你提的蛋白干什么用的，如果尿素硫脲对后续实验没影响的化，可以用7M尿素+2M硫脲溶解；
2. 去除丙酮风干时不宜过久，看不见明显液体即可。
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
9楼2014-12-08 09:05:26
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lwpeng

金虫 (初入文坛)
★ ★
chenct002(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-10 20:08:37
引用回帖:
7楼: Originally posted by chenct002 at 2014-12-07 15:54:35
请问丙酮要是没有完全挥发干净，是不是会影响后续的再溶解，但又不能过度干燥？请问您这个怎么控制呢？...

丙酮沉淀之后要清洗，否则本身就让蛋白变性。这个度确实不好掌握，只有自己具体体会：可以仔细观察沉淀的蛋白边缘还是变透明，但中央较厚部分还没有完全干时，进行溶解。
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10楼2014-12-10 18:45:43
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chenct002: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-12-07 15:51:32
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-07 15:52:35
我做过从肝脏提取碱性磷酸酶，冷丙酮沉淀后，2000rpm离心5分钟，然后用tris缓冲液溶解的。
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2楼2014-12-06 15:50:54
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-07 15:52:43
chenct002: 金币+2, ★有帮助 2014-12-07 15:53:09
转速和时间最初参考相应参考文献，也要根据自己的实验目的和结果调整。溶解液必须用你后续实验的溶液。
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慎思明辨博学笃行
3楼2014-12-06 17:06:26
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lwpeng

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chenct002(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-07 15:52:53
chenct002: 金币+5 2014-12-07 15:53:34
丙酮沉淀后用酒精清洗晾干的时候，不能让蛋白过度干燥，否则溶解是很困难的。
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4楼2014-12-06 22:36:32
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-07 15:53:01
chenct002: 金币+2, ★有帮助 2014-12-07 15:54:49
SDS+超声
字数补丁
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
5楼2014-12-07 02:30:19
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普通回帖

chenct002

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-12-06 15:50:54
我做过从肝脏提取碱性磷酸酶，冷丙酮沉淀后，2000rpm离心5分钟，然后用tris缓冲液溶解的。

请问丙酮沉淀后，沉淀还需要用丙酮洗一遍吗？
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6楼2014-12-07 15:52:55
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chenct002

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lwpeng at 2014-12-06 22:36:32
丙酮沉淀后用酒精清洗晾干的时候，不能让蛋白过度干燥，否则溶解是很困难的。

请问丙酮要是没有完全挥发干净，是不是会影响后续的再溶解，但又不能过度干燥？请问您这个怎么控制呢？
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7楼2014-12-07 15:54:35
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chenct002

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2014-12-07 02:30:19
SDS+超声
字数补丁

这样也是不行，我试过，丙酮沉淀的时候需要加DTT吗？还是直接加丙酮沉淀就好了？
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8楼2014-12-07 15:56:27
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