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丹66

新虫 (初入文坛)

[求助] qPCR绝对定量荧光PCR中做标准质粒获得 已有2人参与

虫友们好,我最近在做土壤微生物QPCR,但是困在了标曲这块,想请问一些关于制作标曲的问题!我理解的制作标曲的步骤是:提取土壤基因组;引物扩增;扩增片段与载体连接转入感受态中;从中筛选几个阳性克隆去测序。我想请教的是,这个方法对不?另外为什么要筛选几个阳性克隆?希望虫友们能指导一下,另外希望虫友们给帮忙推荐几篇详细介绍的文章,嘿嘿……
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steamsn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
丹66: 金币+1 2014-11-29 23:29:35
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-30 15:46:15
测序准确性。文献比较多,自己检索一下/
我命由我不由天
2楼2014-11-29 21:37:46
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丹66

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by steamsn at 2014-11-29 21:37:46
测序准确性。文献比较多,自己检索一下/

也就是从几个克隆里面筛选一个克隆出来,这个克隆的选择依据能具体说一下不丫?嘿嘿

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2014-11-29 22:54:55
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steamsn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-01 16:23:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by 丹66 at 2014-11-29 22:54:55
也就是从几个克隆里面筛选一个克隆出来,这个克隆的选择依据能具体说一下不丫?嘿嘿
...

挑几个克隆,要做验证阳性(比如通过PCR),而后通过测序验证序列的准确性,选择一个阳性克隆扩大培养,提取质粒,进而测定浓度,梯度稀释,获得标准曲线……
我命由我不由天
4楼2014-11-29 23:27:20
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-01 16:23:24
多取几个克隆是为了验证转化子是否正确,而且应该再验证一下是否存在假阳性现象
5楼2014-12-01 15:10:15
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