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丹66

新虫 (初入文坛)

[求助] qPCR绝对定量荧光PCR中做标准质粒获得 已有2人参与

虫友们好，我最近在做土壤微生物QPCR,但是困在了标曲这块，想请问一些关于制作标曲的问题！我理解的制作标曲的步骤是：提取土壤基因组；引物扩增；扩增片段与载体连接转入感受态中；从中筛选几个阳性克隆去测序。我想请教的是，这个方法对不？另外为什么要筛选几个阳性克隆？希望虫友们能指导一下，另外希望虫友们给帮忙推荐几篇详细介绍的文章，嘿嘿……
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1楼 2014-11-29 20:08:40
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steamsn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
丹66: 金币+1 2014-11-29 23:29:35
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-30 15:46:15
测序准确性。文献比较多，自己检索一下/
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我命由我不由天
2楼2014-11-29 21:37:46
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丹66

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by steamsn at 2014-11-29 21:37:46
测序准确性。文献比较多，自己检索一下/

也就是从几个克隆里面筛选一个克隆出来，这个克隆的选择依据能具体说一下不丫？嘿嘿

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-11-29 22:54:55
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steamsn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-01 16:23:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by 丹66 at 2014-11-29 22:54:55
也就是从几个克隆里面筛选一个克隆出来，这个克隆的选择依据能具体说一下不丫？嘿嘿
...

挑几个克隆，要做验证阳性（比如通过PCR），而后通过测序验证序列的准确性，选择一个阳性克隆扩大培养，提取质粒，进而测定浓度，梯度稀释，获得标准曲线……
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我命由我不由天
4楼2014-11-29 23:27:20
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-01 16:23:24
多取几个克隆是为了验证转化子是否正确，而且应该再验证一下是否存在假阳性现象
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5楼2014-12-01 15:10:15
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